(Full Article) (PDF) - Journal für Kulturpflanzen

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JOURNAL FÜR KULTURPFLANZEN, 66 (12). S. 409–416, 2014, ISSN 1867-0911, DOI: 10.5073/JFK.2014.12.02 VERLAG EUGEN ULMER KG, STUTTGART Originalarbeit ...

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JOURNAL FÜR KULTURPFLANZEN, 66 (12). S. 409–416, 2014, ISSN 1867-0911, DOI: 10.5073/JFK.2014.12.02

VERLAG EUGEN ULMER KG, STUTTGART

Originalarbeit

Andreas Peil1, Ofere Emeriewen1,2, Klaus Richter3, Thomas Wöhner1, Mickael Malnoy2, Magda-Viola Hanke1, Henryk Flachowsky1

Vergleichende genetische Kartierung der Feuerbrandresistenz bei Malus sp. Comparative genetic mapping of resistance to fire blight in Malus sp.

409

Zusammenfassung Für die vergleichende Kartierung von Feuerbrandresistenz bei Malus wurden vier Populationen bearbeitet, die als einen Elter einen Donor für Feuerbrandresistenz und als zweiten Elter die anfällige Sorte ‘Idared’ hatten. Als Donoren für Widerstandsfähigkeit wurden definierte Abstammungen der Wildarten M. baccata, M. fusca, M. ×robusta und die widerstandsfähige Pillnitzer Apfelsorte ‘Rewena’ genutzt. Die Phänotypisierung der Populationen erfolgte in unterschiedlichen Jahren durch Inokulation von vegetativen Trieben mit dem Erwinia amylovora-Isolat Ea222 und anderen definierten Isolaten unter Gewächshausbedingungen. Der Befall der Triebe wurde als Befallsrate, dem Verhältnis der befallenen Trieblänge zur Gesamttrieblänge, ermittelt. Je nach Isolat und Population variierte die durchschnittliche Befallsrate zwischen 10 bis 82%. Die Genotypisierung der Nachkommen zur Erstellung genetischer Karten erfolgte mit Mikrosatelliten-, SNP- und DArT-Markern. Die genetischen Kopplungskarten wurden mittels Joinmap 4.0 und die Resistenz gegenüber Feuerbrand mit MapQTL5.0 kartiert. Major-QTLs konnten für M. ×robusta auf Kopplungsgruppe 3, für M. baccata auf Kopplungsgruppe 12 und für M. fusca auf Kopplungsgruppe 10 detektiert werden. Während die Feuerbrand-QTLs von M. ×robusta 5 und M. fusca je nach Jahr bis zu ca. 87% der phänotypischen Varianz erklären können, erklärt der QTL von M. baccata nur ca. 45%, was die Existenz eines zweiten QTL nahe legt. Für die resistente Sorte ‘Rewena’ konnte kein QTL detektiert werden.

Mit den Markern, die im Bereich der detektierten QTLs liegen, kann auf Resistenz gegenüber Feuerbrand selektiert werden. Damit ist eine Kombinierung unterschiedlicher Feuerbrandresistenz-QTLs möglich. Auf dieser Basis können zukünftig Sorten gezüchtet werden, die dauerhaft widerstandsfähig gegenüber Feuerbrand sind, um diese dann dem deutschen Obstbau zur Verfügung stellen zu können. Stichwörter: Feuerbrand, Kartierung, Malus, Resistenz

Abstract Four segregating populations were analyzed for comparative mapping of resistance to fire blight in apple. As donors for resistance the Re-cultivar® ‘Rewena’ from the Pillnitz breeding program, M. ×robusta 5 and the accessions of M. baccata and M. fusca were crossed by the susceptible cultivar ‘Idared’. Phenotyping of resistance in the progeny was done by shoot inoculation using the Erwinia amylovora isolate Ea222 and other defined isolates in greenhouse. The shoot infection was characterized as necrosis rate, the ratio between necrosis length and shoot length. The average necrosis rate varied between 10 to 82% depending on isolate and population. Genotyping was performed with microsatellite-, SNP- and DArT-markers. For the establishment of genetic linkage maps Joinmap 4.0 and for mapping of resistance MapQTL5.0 were used. Major-QTLs were detected on linkage groups 3, 10 and 12 for M. ×robusta 5, M. fusca and M. baccata, respective-

Institut Julius Kühn-Institut, Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen, Institut für Züchtungsforschung an Obst, Dresden1 Instituto Agrario di San Michele all'Adige – IASMA, San Michele all'Adige (TN), Italien2 Julius Kühn-Institut, Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen, Institut für Resistenzforschung und Stresstoleranz, Quedlinburg3 Kontaktanschrift Dr. Andreas Peil, Julius Kühn-Institut, Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen, Institut für Züchtungsforschung an Obst, Pillnitzer Platz 3a, 01326 Dresden, E-Mail: [email protected] Zur Veröffentlichung angenommen 15. September 2014

ANDREAS PEIL et al., Vergleichende genetische Kartierung der Feuerbrandresistenz …

Originalarbeit

ly. Whereas the determined major QTLs of M. ×robusta 5 und M. fusca explained up to 87% of the phenotypic variance, depending on year and isolate, the major QTL detected for M. baccata explained only around 45%, which hypothesizes the presence of additional QTLs. No QTL was detected for the resistant cultivar ‘Rewena’. Based on markers surrounding the detected QTLs a marker assisted selection (MAS) for resistance to fire blight became feasible as well as pyramiding of different QTLs. Pyramiding of differently acting fire blight QTLs shall improve the breeding of durable resistant cultivars in future which will be available for growers.

alle mehr oder weniger stark anfällig für Feuerbrand. Hier kann die Züchtung mit der Bereitstellung Feuerbrand-resistenter Sorten einen wichtigen Beitrag für einen nachhaltigen Apfelanbau liefern. Da eine effektive Züchtung Kenntnisse über die Vererbung gewünschter Merkmale und deren Lokalisation im Genom benötigt, wurde mit einer vergleichenden Kartierung von Widerstandsfähigkeit gegenüber Feuerbrand begonnen. Durch die Kartierung der Feuerbrandresistenz in verschiedenen Donoren sollten unterschiedliche Mechanismen detektiert werden, die dann kombiniert werden könnten, um dauerhafte Widerstandsfähigkeit zu erzeugen.

Key words: Fire blight, Malus, mapping, resistance

2 Material und Methoden 1 Einleitung

410

Feuerbrand ist eine Krankheit an Kernobst, die schon 1794 von DENNING beschrieben wurde und zuerst im Hudson Valley im Staat New York, USA auftrat (DENNING, 1794). Neben den Kernobstarten befällt der Erreger des Feuerbrands, das Bakterium Erwinia amyolovora, auch Zierpflanzenarten der Rosaceaen, wie Cotoneaster oder Crategus. Von den USA ausgehend hat sich das Bakterium mittlerweile in mehr als 40 Ländern ausgebreitet, darunter in den meisten Ländern Europas, Nord-, Mittel- und Südamerikas, in Ägypten, der Türkei und auch in Neuseeland (PEIL et al., 2009). Die Primärinfektion mit Feuerbrand findet während der Blüte statt. Das Bakterium wird von kontaminierten Insekten zu den Blüten gebracht. Auf den Narben kann es sich unter günstigen Bedingungen schnell vermehren, von dort aus über die Nektarien in die Blüten eindringen und sich dann in der Pflanze ausbreiten. Die sekundäre Infektion geschieht über Wunden an jungen Trieben. Typische Symptome von Feuerbrand sind bischofsstabförmige Welkeerscheinungen, die Braun- bis Schwarzfärbung von Trieben, Rindenbrandstellen an verholztem Gewebe und auch das Auftreten von Exsudat, das vom Polysaccharid Amylovoran gebildet wird. Das Exsudat, in dem auch Erwinia-Bakterien vorhanden sind, dient dann wiederum als Inokulumquelle. Neben Insekten stellen Hagelverletzungen einen bedeutenden Weg für die Verbreitung des Bakteriums dar. Der Befall mit E. amylovora kann bis zum Absterben infizierter Bäume führen. Eine effektive und verlässliche Bekämpfung der Krankheit ist bislang nur mit Antibiotika möglich. Der Einsatz von Antibiotika ist aber aus der Sicht des vorbeugenden Verbraucherschutzes und eines nachhaltigen Anbaus unerwünscht und zudem in Europa stark reglementiert oder ganz untersagt. Alternative Mittel sind Kupferpräparate, die auch aus ökologischer Sicht bedenklich sind, bakterielle Antagonisten, Hefepräparate und die Chemikalie LMA, deren Wirksamkeit in der Regel aber begrenzt sind. In den meisten Ländern Europas ist Feuerbrand eine Quarantänekrankheit und ein Befall ist meldepflichtig. Eine Alternative zu den oben genannten Bekämpfungsmöglichkeiten ist der Anbau widerstandsfähiger Sorten. Die im Einzelhandel vertretenen Apfelsorten sind allerdings

2.1 Pflanzenmaterial Für die Kartierung der Resistenz gegenüber Feuerbrand wurden folgende Populationen benutzt: ‘Idared’ × Malus baccata (MAL0004) – Populationsnummer 07240; M. fusca (MAL0045) × ‘Idared’ – Populationsnummer 05210; ‘Idared’ × M. ×robusta 5 (MAL0991) – Populationsnummer 04208; ‘Idared’ × ‘Rewena’ – Populationsnummer 04207. Inokulation der Pflanzen mit Erwinia amylovora: Die Inokulation der Nachkommen erfolgte an Handveredelungen. Dazu wurden im Winter Reiser der betreffenden Nachkommen geschnitten und je nach Verfügbarkeit an Reisermaterial auf jeweils ca. 10 Unterlagen M9 veredelt. Nach Verwachsung der Kambien wurden die Pflanzen im Gewächshaus in Quedlinburg angetrieben. Ab einer Mindestlänge des Neuaustriebs von 25 cm begann die Inokulation mit dem Pathogen. Dazu wurde eine Schere in eine Bakteriensuspension mit einer Konzentration von 109 cfu (colony forming units)/ml getaucht und mit der Schere anschließend die Spitzen der zwei jüngsten Blätter des Neuaustriebes abgeschnitten (Abb. 1). Das Inokulum bestand in jedem Jahr für jede Population aus einem definierten E. amylovora-Stamm (Tab. 1). Die Klimabedingungen im Gewächshaus wurden wie folgt eingestellt: Tag 25–27°C und Nacht 20°C bei einer Luftfeuchte von 85%.

2.2 Bonitur der Triebinokulationen Vier Wochen nach der Inokulation wurde der Befall mit dem Pathogen bonitiert. Dazu wurden die Länge des neu ausgetriebenen Triebes und die Länge der Nekrose, die sich an diesem Trieb gebildet hatte und typische Feuerbrandsymptome aufwies, mit dem Lineal gemessen. Die Widerstandsfähigkeit wurde als Befallsrate, d.h. Prozent befallener Trieb, angegeben: Befallsrate (%) = befallener Trieb/Länge Gesamtneutrieb * 100 Das gesamte inokulierte Pflanzenmaterial wurde durch Autoklavieren vernichtet, da es sich bei Feuerbrand um einen Quarantäneschaderreger handelt.

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ANDREAS PEIL et al., Vergleichende genetische Kartierung der Feuerbrandresistenz …

Originalarbeit Abb. 1. Inokulation von Neutrieben durch Abschneiden der Spitzen der zwei jüngsten Blätter mit einer Schere nach Eintauchen in eine Bakteriensuspension.

Tab. 1. Durchschnittliche Befallsrate (%) für die untersuchten Populationen nach Inokulation mit ausgewählten E. amylovoraIsolaten in unterschiedlichen Jahren Populationsnr./ Jahr 2005 2006 2007 2008 2009

04207

04208

05210

Ea1

Br2

Ea

Br

Ea 222

65,5

Ea222 Ea222

34,7 32,2

Ea3049 ZYRKD3-1 Ea1189 ZYRKD3-1 ZYRKD3-1k3 Ea1189

81,6 67,7 28,1 75,0 80,1 33,2

2011

2012

07240

Ea

Br

Ea222 Ea222

23,1 9,6

Ea3049

62,4

Ea222

9,0

Ea

Br

Ea222 Ea222

31,9 33,6

1 Ea: Erwinia amylovora-Isolat 2 Br: Befallsrate (%) = Länge befallener Trieb im Verhältnis zum Gesamtneutrieb 3 ZYRKD3-1 komplementiert mit dem S-Allel des avrRPT2 -Gens EA

2.3 Molekulare Marker Für die Erstellung genetischer Karten wurden folgende Markersysteme benutzt: Mikrosatelliten (SSRs), Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), Sequence Characterized Amplified Regions und die Diversity Array Technology (DArTs). Die DArT-Marker wurden von Andrzej Kilian, Diversity Array Technology Pty Ltd., Australien, entwickelt, angewandt und die Ergebnisse von ihm ausgewertet. DArT-Marker wurden für jeweils 92 Nachkommen der Populationen 04207 (‘Idared’ × ‘Rewena’) und 05210 (M. fusca × ‘Idared’) benutzt. Die SNP-Analysen fanden am Fondazione Edmund Mach (FEM) in San Michele statt. Ein 384 SNP-Chip wurde für die Detektion polymorpher SNPs für die Populationen 05210 (M. fusca × Idared) und 07240 (‘Idared’ × Malus baccata) benutzt. SSR-Marker wurden für alle Populationen am Julius KühnInstitut (JKI) in Dresden angewandt und durch SSRAnalysen am FEM in San-Michele ergänzt. Am JKI erfolgte die SSR-Analyse in Multiplex-Ansätzen. Die Trennung der PCR-Fragmente wurde mittels Kapillargelelektro-

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phorese (Beckman-Sequenzer) oder vertikaler Plattengelelektrophorese (LiCOR-Sequencer) durchgeführt.

2.4 Kartierung Für die Erstellung genetischer Karten wurden das Programm Joinmap 4.0 (VAN OOIJEN, 2006) und für die Untersuchung der Marker-Phänotyp Assoziation (KruskalWallis Test) und der QTL-Kartierung das Programm MapQTL 5.0 (VAN OOIJEN, 2004) benutzt.

3 Ergebnisse 3.1 Phänotypisierung der Populationen Tab. 1 zeigt die Ergebnisse der Phänotypisierungen als durchschnittliche Befallsrate der Populationen, die in den jeweiligen Jahren mit unterschiedlichen E. amylovoraIsolaten erzielt worden sind. Um eine möglichst gute Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu erzielen, wurde für die Phänotypisierung aller Populationen das E. amylovora-

411

ANDREAS PEIL et al., Vergleichende genetische Kartierung der Feuerbrandresistenz …

Originalarbeit 412

Isolat Ea222 zur ersten QTL Kartierung genutzt. Die Populationen 04208 (‘Idared’ × M. ×robusta 5), 05210 (M. fusca × ‘Idared’) und 07240 (‘Idared’ × Malus baccata) wurden jeweils mindestens in zwei unabhängigen Jahren inokuliert, die Population 04207 (‘Idared’ × ‘Rewena’) nur einmal. Der Grund hierfür war die hohe durchschnittliche Befallsrate dieser Population von 65,5%. Während die Inokulation der Populationen 04208 und 07240 über beide Versuchsjahre einheitliche Ergebnisse zeigten, 32,2 und 34,7% für 04208 und 31,9% und 33,6% für 07240, war die Befallsrate für die Population 05210 in den ersten beiden Jahren mit 23,1 und 9,6% deutlich unterschiedlich. Die dritte Phänotypisierung von 05210 in 2012 mit Ea222 ergab mit einer Befallsrate von 9,0% ein ähnliches Ergebnis wie die Inokulation in 2007 (Tab. 1). Im Gegensatz zum Kartierungsisolat Ea222 erzeugte das Erwinia-Isolat Ea3049 sowohl bei Population 04208 (PEIL et al., 2011) als auch bei Population 05210 bedeutend höhere durchschnittliche Befallsraten (Tab. 1). Während der Feuerbrandresistenzdonor M. fusca (MAL0045) jedoch nur einen prozentualen Befall von 9,0% nach Inokulation mit Ea3049 aufwies, brach das Isolat Ea3049 die Resistenz von M. ×robusta 5 vollständig (Nekroserate: 96,5%). Die avrRpt2EA-Deletionsmutante ZYRKD3-1 (ZHAO et al., 2006) war ebenfalls in der Lage, die Resistenz von M. ×robusta 5 zu brechen und in den Nachkommen mit 67,7 bis 75,0% ein sehr hohe durchschnittliche Befallsrate zu erzielen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit dem Stamm ZYRKD3-1k erzielt. Bei diesem Stamm handelt es sich um die avrRPT2EA-Deletionsmutante ZYRKD3-1, welche mit dem avrRpt2EA Gen aus dem E. amylovora Isolat Ea3049 komplimentiert wurde. Da das avrRPT2EA-Effektorprotein offensichtlich eine zentrale Rolle bei der Resistenz von M. ×robusta 5 zu haben scheint, wurde das avrRpt2EA Gen von verschiedenen Erwinia-Stämmen sequenziert. Dabei konnten zwei Allele des Gens identifiziert werden, S- und C-Allel, die sich in nur einem einzigen SNP unterscheiden (VOGT et al., 2013). Zur Einordnung des Befalls der Population 04208 nach Inokulation mit ZYRKD3-1 wurden die Nachkommen auch mit dem Wildtyp der Deletionsmutante, dem Isolat Ea1189 inokuliert. Die Ergebnisse (Tab. 1) entsprechen denen der Inokulation mit Ea222.

3.2 Genotypisierung und Kartierung der Populationen Die Genotypisierung und die Erstellung genetischer Karten für die einzelnen Feuerbrandresistenzdonoren wurden für ‘Rewena’ von LE ROUX (2011), für M. ×robusta 5 von PEIL et al. (2007), GARCIA-LIBEROS (2012) und WÖHNER et al. (2014) und für M. fusca von EMERIEWEN et al. (2014) durchgeführt und beschrieben. Zur Auffindung von Feuerbrandresistenz-QTLs in M. baccata wurde die Population vornehmlich mit Mikrosatellitenmarkern der Kopplungsgruppen gescreent, auf denen bereits Feuerbrandresistenzloci gefunden worden waren. Zusammen mit SNP-Markern konnten so insgesamt acht Kopplungsgruppen mit insgesamt 60 Markern, die eine Gesamtlänge von 390 cm umspannen, bestimmt werden. Der durchschnittliche Markerabstand beträgt 6,5 cM.

3.3 QTL-Kartierung Die Kartierung der Feuerbrand-QTLs wurde im Wesentlichen für die Bonituren der Jahre 2005 bis 2008 durchgeführt. Für die Population ‘Idared‘ × M. baccata wurden die 2009 erhobenen Boniturdaten als Wiederholung für die Bonitur 2008 mit ausgewertet. 3.3.1 Population 04208 – ‘Idared’ × M. ×robusta 5. Für diese Population wurde auf Kopplungsgruppe 3 (LG 3) ein Major-QTL kartiert (PEIL et al., 2007). Der QTL wurde durch die Inokulationen im Jahr 2006 (PEIL et al., 2008). In Abb. 2 sind die Ergebnisse der QTL-Kartierung der Inokulationen der Jahre 2005 bis 2008 zu sehen. Deutlich wird der Zusammenbruch des Resistenz-QTL auf LG 3 nach Inokulation mit dem Isolat Ea3049, welches die Resistenz von M. ×robusta 5 brechen kann (Abb. 2), dafür konnte aber ein Minor-QTL auf LG 5 mit einem LOD ≥ 3 detektiert werden, der für das Isolate Ea222 nicht vorhanden war (Abb. 3). 3.3.2 Population 05210 – M. fusca × ‘Idared‘. Für M. fusca konnte ein Major-QTL auf Kopplungsgruppe 10 detektiert werden. Da die genetische Karte für M. fusca hauptsächlich aus DArT-Markern bestand, die stark clustern, wurden in den Abb. 4 und 5 einige Marker nicht aufgeführt, da es sonst zu Überlagerungen der Markerbezeichnungen gekommen wäre. Aus diesem Grund gibt Tab. 2 die

Tab. 2. Genetische Karte der Kopplungsgruppe 10 (LG 10) von M. fusca Marker-Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Position (cM)

Locus

0 11.462 12.909 12.944 12.944 12.944 20.510 21.981 21.981 22.013 23.616 23.643 23.643 23.791 23.791 23.940 25.421 34.741 35.660 59.756 59.769 75.941

GD_SNP00604 184374 972352 970891 443272 442947 898994 460883 525997 553933 971449 970425 970518 971614 969611 971227 969555 971000 970840 970048 969599 971659

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ANDREAS PEIL et al., Vergleichende genetische Kartierung der Feuerbrandresistenz …

% Expl. 90

40

80 70

30

60 50

LOD % Expl. Jahr 2005 2006 2008

Isolat Ea222 Ea222 Ea3049

LOD 4.0

3.0

40

2.0

Abb. 2. LOD und % Erklärung der phänotypischen Varianz (% Expl.) nach Inokulation der Population ‘Idared‘ × M. ×robusta 5 in unterschiedlichen Jahren und mit unterschiedlichen Erwinia amylovoraStämmen für Kopplungsgruppe 3 (nach PEIL et al., 2011, geändert).

Isolat Ea222 Ea222 Ea3049

CH05f06 PAGM42_66 P12M39_199 CH03a04 CH04e03

P12M32_195 Hi04d02P

P12M39_248

CH05e06

0.0

PAGM58_248

1.0

PAGM37_271

MS14h03 PAGM32_228 P14M49_281

AU223657 P12M40_271

PAGM32_177 PAGM42_166 PAGM38_356

CH03g07

Hi03d06 PAGM38_374 P12M49_160 E33M32_304

PAGM48_77

0

10 0

CH03e03

30 20

P12M32_226

10

E41M49_82 Hi04a08 CH03a09 PAGM32_221

20

LOD % Expl. Jahr 2005 2006 2008

% Expl. 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Originalarbeit

LOD 50

Abb. 3. LOD und % Erklärung der phänotypischen Varianz (% Expl.) nach Inokulation der Population ‘Idared’ × M. ×robusta 5 in unterschiedlichen Jahren und mit unterschiedlichen Erwinia amylovoraStämmen für Kopplungsgruppe 5 (nach PEIL et al., 2011, geändert).

413 50

K*

K*

Jahr 2006 2007

LOD 25

% Expl. 90

40

80 20

30

LOD % Expl. Jahr 2006 2007

70 60

15

50 40

20

10

10

5

20

0

10 0

971659

970048

971000 970840

898994 460883 969555

184374 972352

971659

970048

971000 970840

898994 460883 969555

184374 972352

GD_SNP00604

0

GD_SNP00604

30

Abb. 4. Kruskal-Wallis Analyse nach Inokulation der Population M. fusca × ‘Idared‘ in den Jahren 2006 und 2007 mit dem ErwiniaIsolat Ea222 für Kopplungsgruppe 10.

Abb. 5. LOD (logarithm of the odd) und % Erklärung der phänotypischen Varianz (% Expl.) nach Inokulation der Population M. fusca × ‘Idared‘ in den Jahren 2006 und 2007 mit dem Erwinia-Isolat Ea222 für Kopplungsgruppe 10.

Reihenfolge und die genetischen Abstände der Marker auf Kopplungsgruppe 10 vollständig wieder. Abb. 4 zeigt die Ergebnisse der Kruskal-Wallis Analyse für Kopplungsgruppe 10. Die höchste Assoziation zwischen Marker und Ausprägung des Phänotyps sind in beiden betrachteten Jahren 2006 und 2007, trotz großer Unterschiede in der durchschnittlichen prozentualen Nekroserate, für die beiden DArT-Marker 971000 und 970840 zu beobachten. Die Marker haben eine Distanz von ca. 0,9 cM und der Peak der Kurve liegt über Marker 971000. Die Ergebnisse des QTL-Mappings sind für die Jahre 2006 und 2007 in Abb. 5 dargestellt. Die maximalen LODWerte liegen wiederum bei den beiden DArT-Markern 971000 und 970840, mit ca. 14 für 2006 und 22 für 2007. Damit wurde der QTL in beiden Jahren bestätigt und erklärt im Jahr 2007 bis zu 87% der phänotypischen Varianz.

Major-QTL auf Kopplungsgruppe 12 lokalisiert werden. Abb. 6 zeigt die Phänotyp-Marker Assoziation. In beiden Jahren wies der Mikrosatellit Hi07f02 die höchste Korrelation zu den phänotypischen Daten auf. Die QTL-Kartierung mit Map-QTL ergab die höchste statistische Sicherheit für einen Zusammenhang zwischen Marker und Merkmal ebenfalls für Hi07f02, weswegen ein Multiples QTL Mapping (MQM) mit dem Marker Hi07f02 als Co-Faktor durchgeführt wurde (Abb. 7). Etwa 45% der phänotypischen Varianz werden durch den QTL im Jahr 2009 erklärt (Abb. 7).

3.3.3 Population 07240 – ‘Idared’ × M. baccata. Es konnte

für beide Phänotypisierungsjahre mit Ea222 jeweils ein

Journal für Kulturpflanzen 66. 2014

3.3.4 Population 04207 – ‘Idared‘ × ‘Rewena‘. Für die Po-

pulation 04207 wurde eine genetische Karte mit DArTund SSR-Markern für die Identifizierung der Kopplungsgruppen erstellt. Die phänotypischen Daten stammen aus der Inokulation der veredelten Nachkommen mit dem Erwinia-Isolat Ea222 im Jahr 2005. Es konnte kein QTL mit einer ausreichend hohen statistischen Sicherheit für

ANDREAS PEIL et al., Vergleichende genetische Kartierung der Feuerbrandresistenz …

K*

Jahr 2008 2009

LOD 15

% Expl. 50

40

40

LOD % Expl. Jahr 2008 2009 Cofactor

10 30

30

20

20

5

10

10

CH01g12 CH04g04 CHFb02_230

CH01f02

Hi07f01

CHfb08-245/ CHFb01-245

GD_SNP00391

CH04g04 CHFb02_230

CH01g12

CH01f02

Hi07f01 CHfb08-245/ CHFb01-245

CH03c02

GD_SNP01029 GD_SNP00318

GD_SNP00391

CH03c02

0

0

GD_SNP01029 GD_SNP00318

Originalarbeit

K* 50

0

Abb. 6. Kruskal-Wallis Analyse nach Inokulation der Population ‘Idared‘ × M. baccata in den Jahren 2008 und 2009 mit dem ErwiniaIsolat Ea222 für Kopplungsgruppe 12.

Abb. 7. LOD (logarithm of the odd) und % Erklärung der phänotypischen Varianz (% Expl.) nach Inokulation der Population ‘Idared‘ × M. baccata in den Jahren 2008 und 2009 mit dem Erwinia-Isolat Ea 222 für Kopplungsgruppe 12.

die Feuerbrandresistenz von ‘Rewena‘ detektiert werden (LE ROUX, 2011).

mit bereits bekannten Feuerbrand-QTLs auf den entsprechenden Kopplungsgruppen der genetischen KonsensusKarte für Apfel (SILVERBERG-DILWORTH et al., 2006). Insgesamt stehen jetzt fünf Major-QTLs verteilt auf vier Kopplungsgruppen zur Verfügung, die in der Züchtung kombiniert werden können.

414

3.4 Vergleich der Positionen der Feuerbrand-QTLs Eine Übersicht über die identifizierten QTLs gibt Tab. 3. Daneben werden die entsprechenden Kopplungsgruppen, das für die Phänotypisierung benutzte Erwinia-Isolat, das Maß der statistischen Absicherung des QTL (LOD) und der Anteil der phänotypischen Varianz, die der QTL erklären kann, wiedergegeben. Deutlich wird, dass insbesondere die Lokalisierung der Feuerbrandresistenz auf den Kopplungsgruppen 3 bzw. 10 der Donoren M. ×robusta 5 und M. fusca sehr sicher ist und dass die Wirksamkeit dieser QTLs in einem sehr hohen Maß vererbt wird. Dagegen ist die statistische Sicherheit für den Minor-QTL auf Kopplungsgruppe 5 von M. ×robusta 5 nach Inokulation mit dem Resistenz-brechenden Isolat Ea3049 mit einem LODWert von 3 relativ gering (Tab. 3). Der Feuerbrand-QTL auf Kopplungsgruppe 12 von M. baccata wird für beide Phänotypisierungsjahre bestätigt, fällt aber in seiner Wirkung deutlich gegenüber den QTLs von M. fusca und M. ×robusta 5 ab. Abb. 8 zeigt eine Einordnung und Lokalisation der hier beschriebenen QTLs für Resistenz gegenüber Feuerbrand

4 Diskussion Ein großes Problem bei der Kartierung von Feuerbrandresistenz ist die Bestimmung der Anfälligkeit bzw. Resistenz von Malus-Genotypen. Der natürliche Befall durch Blüteninokulation im Versuchsfeld scheint ein realistischeres Bild der Resistenz als die künstliche Triebinokulation im Gewächshaus zu geben. Durch die ungleichen Inokulationsbedingungen im Freiland wird in der Regel aber die Resistenz überschätzt (PEIL et al., 2009), während im Gewächshaus in der Regel die Anfälligkeit überschätzt wird. Für die Kartierung müssen vergleichbare Inokulationsbedingungen für eine Population gegeben sein, weswegen sich für diesen Zweck die Inokulation im Gewächshaus durchgesetzt hat. Diese wird am JKI ähnlich der cut-leaf-Methode (MAAS GEESTERANUS et al., 1981)

Tab. 3. Auflistung von QTLs für Feuerbrandresistenz, der jeweiligen Kopplungsgruppe, der LOD-Werte (logarithm of the odd) und des Anteils der phänotyipschen Varianz (% Expl.) der durch den QTL nach Inokulation mit dem angegebenen ErwiniaStamm erklärt werden kann

M. baccata M. fusca M. ×robusta 5 Rewena

Erwinia-Isolat

Kopplungsgruppe

LOD

% Expl.

Ea 222 Ea 222 Ea 222 Ea 3049 Ea 222

12 10 3 5 –

8–14 14–23 30–42 3 –

30–45 75–87 64–87 10 –

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Originalarbeit

Major QTL (R = M. ×robusta 5, F = Fiesta, Mb = M. baccata, E/Mf = Evereste, M. floribunda, Mfu = M. fusca) Minor QTL

durchgeführt. Da auch Wirt-Pathogen-Interaktionen beschrieben sind (NORELLI et al., 1984), wurden alle vier Kartierungspopulationen mit dem Kartierungsisolat Ea222 inokuliert. Bei der Phänotypisierung von Wiederholungen eines Genotyps kann eine große Varianz auftreten, weswegen eine ausreichende Anzahl an Wiederholungen getestet werden muss. Aus diesem Grund wurden am JKI die drei Populationen ‘Idared’ × M. baccata, M. fusca × ‘Idared’ und ‘Idared’ × M. ×robusta 5 wenigstens zwei Jahre mit Ea222 inokuliert. Während für die Populationen ‘Idared’ × M. baccata und ‘Idared‘ × M. ×robusta 5 die durchschnittlichen Nekroserate beider Jahre sehr eng zusammenliegen (34,7% bzw. 32,2% für M. ×robusta 5 und 31,9% bzw. 33,6% für M. baccata), sank bei der zweiten Inokulation der M. fusca × ‘Idared’ Nachkommenschaft mit Ea222 die durchschnittliche Nekroserate von 23,1% auf 9,6%; eine dritte Inokulation mit Ea222 im Jahr 2012 ergab nur 9,0%. Ein Grund für diesen Unterschied ist bislang nicht erkennbar. Für M. ×robusta 5 war bekannt, dass es Erwinia-Isolate gibt, die die Resistenz brechen können (NORELLI et al., 1984). Aus diesem Grund wurde die M. ×robusta 5 Population mit dem Isolat Ea3049 inokuliert, was zu einer durchschnittlichen Nekroserate von 81,6% führte. Dieser hoch virulente Stamm, der M. fusca kaum befallen konnte (9,0% Nekroserate), wurde auch für die Phänotypisierung der M. fusca-Nachkommenschaft benutzt und erzeugte dort eine durchschnittliche Befallsrate von 62,4%. Die hohen Befallsraten von M. ×robusta 5 und der daraus entstandenen Nachkommenschaft nach Inokulation mit Ea3049 weisen auf ein einzelnes Major-Resistenzgen für diesen Donor hin. Die gute Widerstandsfähigkeit von M. fusca und die hohe Anfälligkeit der Population lassen

Journal für Kulturpflanzen 66. 2014

Abb. 8. Position von Quantitative Trait Loci (QTL) für Resistenz gegenüber Feuerbrand, basierend auf der Rumpfkarte, die von SILVERBERG-DILWORTH et al. (2006) entwickelt wurde (nach PEIL et al., 2009, verändert).

vermuten, dass dieser Donor mindestens zwei Major-Resistenzgene hat oder zwei Faktoren, die zusammen an die Nachkommen vererbt werden müssen, um auch Widerstandsfähigkeit gegenüber diesem Isolat zu erzielen. Die Nachkommen von ‘Idared‘ × ‘Rewena‘ zeigten diesen hohen Grad an Anfälligkeit (65,5%) schon mit dem weniger virulenten Kartierungsisolat Ea222. In der Literatur sind bislang vier Major-QTLs beschrieben: auf Kopplungsgruppe 3 für M. ×robusta 5 (PEIL et al., 2007, 2008), auf Kopplungsgruppe 7 für ‘Fiesta’ (KHAN et al., 2006) und auf Kopplungsgruppe 12 für die Zierapfelsorte ‘Evereste’ und den Rvi6 Schorfresistenz-Donor M. floribunda 821 (DUREL et al., 2009). Die beiden MajorQTLs auf Kopplungsgruppe 12 kartieren im selben Intervall und könnten allelisch sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für M. baccata ebenfalls ein Major-QTL auf Kopplungsgruppe 12 lokalisiert, der jedoch einige cM entfernt von den QTLs im Genom von ‘Evereste’ und M. floribunda 821 zu liegen scheint. Inwieweit die QTLs auf Kopplungsgruppe 12 doch übereinander liegen und allelisch sind, muss in weiteren Analysen geklärt werden. Der geringe Anteil der phänotypischen Varianz, der durch den Locus auf Kopplungsgruppe 12 von M. baccata erklärt werden kann, deutet daraufhin, dass in M. baccata mindestens ein weiterer QTL-für Resistenz gegenüber Feuerbrand existiert. Die Strategie zuerst nur Kopplungsgruppen zu kartieren, auf den bereits Feuerbrand-QTLs identifiziert worden sind, war zwar erfolgreich, aber nicht ausreichend. Ergänzende Kartierungsarbeiten sind erforderlich, um nach weiteren QTLs zu suchen. Für M. fusca ergab die Kartierung mit DArT Markern eine starke Assoziation zweier Marker mit der Widerstandsfähigkeit gegenüber Feuerbrand. Diese Marker konnten anhand der veröffentlich-

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Originalarbeit 416

ten Genomsequenz von ‘Golden Delicious’ (VELASCO et al., 2010) Kopplungsgruppe 10 zugeordnet werden. Im Rahmen einer Dissertation in Kooperation mit Mickael MALNOY vom Instituto Agrario di San Michele all'Adige (IASMA), San Michele all'Adige (TN), Italien, konnte mittlerweile eine genetische Karte von M. fusca entwickelt und der Feuerbrand-QTL mit SSR-Markern kartiert werden (EMERIEWEN et al., 2014). In der Zwischenzeit konnte das dem Major-QTL auf Kopplungsgruppe 3 von M. ×robusta 5 zugrunde liegende Gen isoliert und erfolgreich in die Apfelsorte ‘Gala‘ transformiert werden (FAHRENTRAPP et al., 2013; BROGGINI et al., 2014). Die QTL-Kartierung nach Inokulation der M. ×robusta 5-Population mit dem M. ×robusta 5-Resistenz brechenden Isolat Ea3049 führte zum völligen Zusammenbruch des Major-QTLs auf Kopplungsgruppe 3 und zur Detektion eines Minor-QTL auf Kopplungsgruppe 5 (PEIL et al., 2011), der jedoch nur ca. 10% der phänotypischen Varianz erklären kann. GARDINER et al. (2012) beschreiben einen Minor-QTL auf Kopplungsgruppe 7 von M. ×robusta 5, der nach Abdeckung der genetischen Kopplungskarte mit Markern, insbesondere für die Kopplungsgruppen 6 und 7 von M. ×robusta 5, für die Inokulation mit dem Resistenz-brechenden Isolat Ea3049 bestätigt werden konnte (WÖHNER et al., 2014). Die spezifische Wirt-Pathogen-Interaktion von M. ×robusta 5 mit verschiedenen Erwinia-Isolaten zeigt, dass ein einziger SNP in einem Avirulenzgen zur Überwindung der Resistenz gegenüber Feuerbrand führen kann (VOGT et al., 2013). Die Überwindung dieser Resistenz demonstriert die Notwendigkeit der Züchtung dauerhaft widerstandsfähiger Sorten. Dies kann durch eine Pyramidisierung unterschiedlicher Resistenzmechansimen geschehen. Die Tatsache, dass in verschiedenen Wildarten jeweils Major-QTLs auf unterschiedlichen Kopplungsgruppen gefunden wurden, weist eindeutig auf unterschiedliche Mechanismen hin. Die Züchtung arbeitet jetzt an der Kombination unterschiedlicher QTLs. Die Nachkommen solcher Kreuzungen können dann mit molekularen Markern auf die Pyramidisierung der Resistenz-QTLs gescreent werden. In einem zweiten Schritt müssen dann die Genotypen mit pyramidisierten QTLs und Genotypen mit nur einem einzelnen QTL als Vergleich mit hoch virulenten Erregerstämmen inokuliert werden, um Aussagen über die Wirksamkeit der Pyramidisierung treffen zu können.

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