Physiologischer Zustand von rekombinanten Escherichia coli in

Physiologischer Zustand von rekombinanten Escherichia coli in

Physiologischer Zustand von rekombinanten Escherichia coli in Hochzelldichtekultivierungen bei der Produktion eines humanen Proteins Von der Gemeinsa...

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Physiologischer Zustand von rekombinanten Escherichia coli in Hochzelldichtekultivierungen bei der Produktion eines humanen Proteins

Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat.)

genehmigte Dissertation

von Frank Hoffmann aus Wipperfürth

1. Referentin oder Referent:

PD Dr. U. Rinas

2. Referentin oder Referent:

Prof. Dr. W.-D. Deckwer

eingereicht am:

17.5.1999

mündliche Prüfung (Disputation) am:

23.7.1999

Druckjahr:

1999

Vorveröffentlichungen der Dissertation

Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät, vertreten durch die Mentorin der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht:

Tagungsbeiträge F. Hoffmann; M. Schmidt; U. Rinas 1997. Zellphysiologische Aspekte der bakteriellen Produktion des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors im Hochzelldichteverfahren. Vortragstagung des GVC-Fachausschusses „Bioverfahrenstechnik“ und des DECHEMAArbeitsausschusses „Technik biologischer Prozesse“ zum Thema „Verfahrenstechnische Grundlagen und Modellierung von Bioprozessen“, 5. – 6. Mai, Goslar, F.R.G. J. Weber; F. Hoffmann; M. Schmidt; U. Rinas 1999. Intrazelluläre Stoffflüsse in rekombinanten Escherichia coli während Wachstum und heterologer Proteinproduktion. Vortragstagung

des

GVC-Fachausschusses

„Bioverfahrenstechnik“

und

des

DECHEMA-

Arbeitsausschusses „Technik biologischer Prozesse“ zum Thema „Wechselwirkung zwischen Biologie und Prozeßführung“, 10. – 11. Mai, Erfurt, F.R.G.

Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom Februar 1996 bis April 1999 im Bereich Bioverfahrenstechnik der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) in Braunschweig unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. W.-D. Deckwer angefertigt. Herrn Professor Deckwer danke ich für die Möglichkeit, in der GBF zu arbeiten, für sein stetes Wohlwollen und die freundliche Übernahme des Referates. Mein besonderer Dank gilt Frau PD Dr. U. Rinas für das interessante Thema, für fruchtbare Anregung, konstruktive Kritik und gelegentliche Aufmunterung. Ein herzlicher Dank gilt Frau S. Marten und Herrn Dipl.-Ing. (FH) M. Schmidt, die bei den praktischen Laborarbeiten und bei den Kultivierungen im technischen Maßstab eine unverzichtbare Hilfe waren. Für die Unterstützung bei genetischen Arbeiten bin ich Herrn Dr. J. J. van den Heuvel und Frau U. Widow verbunden. Den Herren Dipl.-Biotechnologen E. Grothe, J. Schütze und besonders J. Weber danke ich für die kritische Durchsicht der Arbeit. Frau Dr. A. Kayser und Herrn J. Weber danke ich für Nukleotid-HPLC-Daten. Herrn Dr. C. Müller danke ich für das angenehme Arbeitsklima und manchen Ratschlag. Herrn Prof. Dr. A. Villaverde, Frau A. Arís, Herrn Dr. J.L. Corchero und Herrn Dr. J. Feliu danke ich für die Unterstützung während eines Aufenthalts an der Universitat Autònoma de Barcelona. Nicht zuletzt verdanke ich meinen Familien mehr, als an dieser Stelle gesagt werden kann.

Inhaltsverzeichnis 1

Einleitung....................................................................................................................... 1 1.1 Einführung ................................................................................................................. 1 1.2 Zielsetzung ................................................................................................................. 5 2 Theoretische Grundlagen................................................................................................ 6 2.1 Einflüsse auf den physiologischen Zustand des Wirtsorganismus................................ 6 2.1.1 Temperatur ......................................................................................................... 6 2.1.2 Streßreaktion Hitzeschockantwort....................................................................... 8 2.1.3 Substratlimitierung und Regulation der Stoffflüsse ........................................... 12 2.1.4 Streßreaktion Hungerantwort ............................................................................ 14 2.1.5 Einfluß von Plasmidpräsenz und Synthese Plasmid-kodierter Proteine.............. 16 2.1.6 Streßreaktion stringente Antwort ...................................................................... 17 2.2 Einfluß der Prozeßbedingungen auf die Produktion rekombinanter Proteine ............. 18 2.3 Einschlußkörper als Nebenprodukt der Proteinfaltung .............................................. 21 2.4 Einfluß des Wirtes auf die Proteinfaltung.................................................................. 25 2.4.1 Aufgaben und Funktionsweisen von Chaperonen .............................................. 25 2.4.2 Chaperone und rekombinante Proteine.............................................................. 30 3 Material und Methoden ................................................................................................ 32 3.1 Stamm und Plasmide ................................................................................................ 32 3.2 Medien und Vorkulturen........................................................................................... 33 3.3 Reaktor und Prozeßführung ...................................................................................... 34 3.4 Protein-Analytik ....................................................................................................... 35 3.4.1 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)....................... 35 3.4.2 Zweidimensionale Gelelektrophorese................................................................ 37 3.4.3 Blotting............................................................................................................. 41 3.4.4 Radioaktive Markierung ................................................................................... 42 3.5 Analytik biologischer Größen................................................................................... 42 3.6 Online Bestimmung der Biomasse ............................................................................ 44 3.7 Berechnungen von Stoffströmen............................................................................... 46 3.8 Parameteridentifikation............................................................................................. 47 4 Ergebnisse und Diskussion ........................................................................................... 48 4.1 Akkumulation von löslichem und aggregiertem bFGF .............................................. 48 4.1.1 Typischer Verlauf einer Standardkultivierung ................................................... 48 4.1.2 Vergleich von Kultivierungen mit unterschiedlichen Zufütterungsraten ............ 51 4.1.3 Einfaches Modell für die Faltung von bFGF ..................................................... 52 4.1.3.1 Annahmen des Modells................................................................................. 52 4.1.3.2 Parameteridentifikation................................................................................. 54 4.1.3.3 Voraussagen des Modells.............................................................................. 57 4.1.4 Pulse-Chase-Experimente ................................................................................. 59 4.2 Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen .............................. 61 4.2.1 Überblick.......................................................................................................... 61 4.2.2 Proteinsyntheseleistung als Maß für die Vitalität............................................... 67 4.2.2.1 Gesamttranslation und Protein-produzierendes System ................................. 67 4.2.2.2 Verlust der Translationskapazität?................................................................. 70 4.2.3 Plasmid-kodierte Proteine ................................................................................. 71 4.2.3.1 Plasmidmassenanteil ..................................................................................... 71 4.2.3.2 Bildungsgeschwindigkeit von bFGF.............................................................. 74 4.2.3.3 Konstitutiv synthetisierte Plasmid-kodierte Proteine...................................... 75 4.2.4 Von σ32 (rpoH) kontrollierte Hitzeschockantwort ............................................. 79 4.2.4.1 Induktionsverhältnisse von Hitzeschockproteinen ......................................... 79

4.2.4.2 Kinetik der Hitzeschockantwort .................................................................... 82 4.2.4.3 Stärke der Hitzeschockantwort...................................................................... 84 4.2.4.4 Konzentrationen von DnaK, dem Regulator der Hitzeschockantwort ............ 86 4.2.5 Nicht von σ32 (rpoH) kontrollierte Hitzeschockproteine.................................... 88 4.2.5.1 Kinetik der Bildung kleiner Hitzeschockproteine .......................................... 88 4.2.5.2 Anhaltspunkte zum Verständnis der Regulation ............................................ 90 4.2.6 Periplasmatische Proteine ................................................................................. 92 4.2.7 Metabolische Enzyme....................................................................................... 97 4.2.8 Anteil nicht-wachstumsfördernder Proteine an der Gesamtproteinsynthese ..... 104 4.3 Online verfügbare Informationen zu Wachstum und Stoffwechsel .......................... 108 4.3.1 Kohlenstoffbilanz ........................................................................................... 108 4.3.1.1 Stoffströme und Ausbeutekoeffizienten....................................................... 108 4.3.1.2 Spezifische Verlustrate ............................................................................... 110 4.3.2 Redoxbilanz.................................................................................................... 111 4.3.3 Energiebilanz.................................................................................................. 111 4.3.3.1 Nicht-wachstumsgekoppelter Energiebedarf................................................ 111 4.3.3.2 Verlust energiereicher Substanzen?............................................................. 113 4.3.3.3 Verringerte Effizienz der Energieproduktion? ............................................. 115 4.3.3.4 Produktion nicht-wachstumsfördernder Proteine? ....................................... 117 4.3.4 Überwachung des physiologischen Zustands mit online Meßgrößen ............... 120 5 Zusammenfassung und Ausblick ................................................................................ 124 6 Literaturverzeichnis.................................................................................................... 128 7 Anhang....................................................................................................................... 144 7.1 Ausbeutekoeffizienten ............................................................................................ 144 7.2 Modell für die Bildung, Faltung und Degradation von bFGF .................................. 144

Symbole und Abkürzungen Verwendete Symbole und ihre Einheiten Symbol BM c F f k J M m m‘ MW N pI Q q r RQ S t V X x Y Y‘ y Pˆ

γ ∆κ µ σ %P

Bezeichnung Biomasse Konzentration Zufütterungsmassenstrom Anteil einer Proteinfraktion an dem Gesamtprotein Proportionalitätsfaktor Residuum (Maß für die Abweichung der Simulationsrechnung von den Meßwerten) Masse nicht-wachstumsgekoppelter Energiebedarf Erhaltungsenergiebedarf Molekulargewicht Molvolumen des Idealen Gases Isoelektrischer Punkt volumetrischer Stoffstrom spezifischer Stoffmengenstrom („Rate“ von Kohlenstoff) Stoffmengenstrom (von Kohlenstoff) Respirationsquotient Glukosekonzentration Zeit Reaktorvolumen Zelldichte Stoffmengenanteil beobachteter Ausbeutekoeffizient „wahrer“ Ausbeutekoeffizient Modellausgangsvektor Schätzwert für den Parametervektor P Reduktionsgrad einer Substanz Differenz zwischen gemessener und linear aus der Fed-Batch-Phase I extrapolierter Leitfähigkeit spezifische Wachstumsrate Standardabweichung der Messung (spezifische Proteinkonzentration) Anteil eines Proteins am Gesamtprotein

Einheit g g g-1 g h-1 g mol g-1 h-1 mol g-1 h-1 g mol-1 L mol-1 mol L-1 h-1 mol g-1 h-1 mol h-1 mol mol-1 g g-1 h L g L-1 mol mol-1 mol mol-1 mol mol-1 mg g-1 mS cm-1 h-1 mg g-1 %

Verwendete Indices und ihre Größen ohne Index verwendete Größen beziehen sich auf den aktuellen Zeitpunkt Index A ATP C CO2 F f G HAc i in L Lauge M max NH3 nwf O2 online out P S set Verlust X

Bedeutung bezogen auf die unlösliche Zellfraktion bezogen auf ATP bezogen auf Kohlenstoff bezogen auf Kohlendioxid in der Zufütterungslösung zum Zeitpunkt des Zufütterungsstarts bezogen auf das Gesamtprotein bezogen auf Essigsäure bezogen auf die betrachtete Größe bzw. den jeweiligen Zeitpunkt bezogen auf in den Reaktor eintretende Stoffströme bezogen auf die lösliche Zellfraktion bezogen auf die zur pH-Regelung verbrauchte Lauge bezogen auf Meßwerte maximale Geschwindigkeit bezogen auf Ammonium bezogen auf nicht-wachstumsfördernde Proteine bezogen auf Sauerstoff aus online meßbaren Größen abgeschätzt bezogen auf den Reaktor verlassende Stoffströme bezogen auf das rekombinante Protein bezogen auf das Substrat in der Zufütterungsformel vorgegeben bezogen auf die Differenz in der Kohlenstoffbilanz bezogen auf die Biomasse

Verwendet mit f, %P Y c, MW Q, q S t, X, V %P MW, k t, γ, q, σ x f, %P M y µ, YATP,CO2 Y, c q, Y, %P Q, q, γ BM x Y m, Y, r, q, γ µ q, Y, γ Y, q, MW, γ

Abkürzungen ADP AEC

Adenosin-Diphosphat Adenylat energy charge; Verhältnis der Zahl energiereicher Phosphatbindungen zur Summe der Adenylat-Nukleotid-Konzentrationen (normiert mit 0,5) AMP Adenosin-Monophosphat ATP Adenosin-Triphosphat cAMP 2‘,3‘-zyklisches Adenosin-Monophosphat CER Kohlendioxidbildungsrate IEF Isoelektische Fokussierung MilliQ doppelt-deionisiertes Wasser NEpHGE Nicht-Gleichgewichts-pH-Elektrophorese OD Optische Dichte (Absorption bei einer Wellenlänge von 660 nm) OUR Sauerstoffaufnahmerate PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese ppGpp Guanosin-3‘,5‘-bis(diphosphat) (p)ppGpp ppGpp bzw. das GTP-Analog SDS Natriumlaurylsulfat TCA Tricarbonsäurezyklus

1.1. Einführung

1

1 Einleitung 1.1 Einführung Die Nachfrage nach humanen Proteinen, die als Therapeutika benötigt oder für Forschungszwecke eingesetzt werden, kann nicht aus natürlichen Vorkommen befriedigt werden. Rekombinante Mikroorganismen stellen eine nützliche Quelle vieler Proteine dar, weil sie zwei Kriterien für gute volumetrische Produktivität erfüllen: schnelle Produktion und Wachstum bis zu hohen Zelldichten. Das einfachste Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen ist die Satzkultivierung (auch Batch oder absatzweise Kultivierung genannt). Das vorgelegte Substrat wird dabei verbraucht, die Mikroorganismen wachsen unlimitiert mit maximaler spezifischer Wachstumsrate. Die Vitalität und spezifische Produktionsgeschwindigkeit sind dabei optimal. Die vorzulegende Substratkonzentration ist aber begrenzt, so wird z. B. Escherichia coli durch eine Glukose-Konzentration von 50 g L-1 vollständig inhibiert. Bei Salzen kann die geringe Löslichkeit die vorzulegenden Konzentrationen beschränken. Daher können in Satzkultivierungen am Kultivierungsende nur relativ geringe Zelldichten erreicht werden. Dies erschwert die Aufarbeitung und begrenzt die volumetrische Produktivität des Prozesses. Zur Steigerung der volumetrischen Produktivität werden Hochzelldichteverfahren angewandt, bei denen sich an die Batch-Phase eine Zufütterungsphase anschließt. Dabei müssen die Sauerstoffzufuhr- und Wärmeabfuhrkapazitäten des Reaktors berücksichtigt und muß der „bakterielle Crabtree-Effekt“1 vermieden werden. Die Zufütterungsrate des Substrats und damit die Wachstumsrate sind beschränkt, wodurch die spezifische Produktivität im Vergleich zu Satzkultivierungen kleiner ist. Zufütterungsstrategien reichen von linearer Zufütterung bis zum Gebrauch komplexer mathematischer Modelle; teilweise wird die Zufütterungsrate geregelt, um eine bestimmte Substratkonzentration zu halten (Kleman und Strohl, 1995; Lee, 1996). In dieser Arbeit wurde eine exponentiell mit der Zeit zunehmende Zufütterungsrate, die vor der Induktion der Synthese des rekombinanten Proteins Wachstum mit konstanter Rate erlaubte, verwendet (Korz et al., 1995). Hochzelldichtekultivierungen dieser Art von rekombinanten E. coli zur Herstellung von Proteinen sind vielfach eingesetzt worden (Zabriskie et al.; 1987; Yang et al.; 1992; Hellmuth et al., 1994; Strandberg et al., 1994; Turner et al., 1994).

1

Ein Überflußmetabolismus, der bei E. coli zur Exkretion von Essigsäure führt, welche das Wachstum des Organismus und die Akkumulation des rekombinanten Proteins inhibiert (Han et al., 1992; 1993). Der Begriff Crabtree-Effekt ist ursprünglich für Hefe eingeführt worden.

2

1. Einleitung

Speziell untersuchten Seeger et al. (1995) die Herstellung des humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF). Es handelt sich dabei um ein kleines Protein mit 155 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 16 kDa. Es weist ausschließlich β-Faltblattstrukturen auf. Wegen seiner stark mitogenen Eigenschaft wird es therapeutisch zur Wundheilung und in der Zellkulturtechnik eingesetzt. In Escherichia coli TG1, der das Plasmid pλFGFB trägt, wird durch einen Temperatursprung von 30°C auf 42°C die bFGF-Biosynthese induziert. Dabei akkumuliert das rekombinante Protein z. T. in unlöslicher, inaktiver Form. Es kann solubilisiert und in vitro unter reduzierenden Bedingungen zurückgefaltet werden; allerdings verläuft dieser Prozeß sehr langsam (Estapé und Rinas, unveröffentlicht). Lösliches bFGF ist dagegen leicht durch Heparin-Affinitätschromatographie aufzureinigen; die Bildung löslichen bFGFs ist daher erwünscht. Seeger et al. (1995) untersuchten deshalb auch die Produktion mit einem Temperatur-unabhängigen, chemisch-induzierbaren System, bei dem bFGF ausschließlich in aktiver Form akkumulierte, fanden aber wegen der geringen PromotorStärke2 nur ein Zehntel der mit TG1 pλFGFB erreichten bFGF-Konzentration. In der vorliegenden Arbeit wird daher E. coli TG1 pλFGFB zur Herstellung von bFGF in technischem Maßstab benutzt. Bei starken Promotoren ist die Regulation der Transkription essentiell, da die konstitutive Produktion des Fremdgens die Vitalität des Wirts beeinträchtigen würde; Wachstumsrate und Plasmidstabilität würden verringert (s. 2.1.4). Induzierbare Promotor-Systeme erlauben eine Trennung in Trophophase, in der die Biomasse zu hoher Zelldichte wächst, und Ideophase zur Produktbildung. Einen Überblick über gängige Induktionssysteme geben Friehs und Reardon (1993). Das in dieser Arbeit verwendete λPRPL-System wird durch den Temperaturempfindlichen Repressor cIts kontrolliert. Bei 42°C kann er nicht mehr dimerisieren und verliert dadurch seine Affinität zum Operator3; die Transkription des bFGF-Gens vom λPRPLPromotortandem aus kann beginnen. Das starke λPRPL-Promotorsystem kann also ökonomisch durch eine Erhöhung der Kultivierungstemperatur auf 42°C induziert werden. Die

gewählten

Kultivierungsbedingungen

(Hochzelldichtekultivierung,

Temperatur-

Induktion) sind an industrielle Produktionsprozesse angelehnt. Sie beeinflussen jedoch zum einen die Produktqualität (Bildung von unlöslichen Proteinaggregaten ohne biologische Akti-

2

Als Promotoren werden Sequenzen „oberhalb“, also Richtung 5‘-Ende der DNA, eines Gens bezeichnet, an die die „Spezifitäts“-Untereinheit Sigma der RNA-Polymerase mit hoher Affinität – diese bestimmt die „PromotorStärke“ – bindet. Nach ihrer Position unterscheidet man –10-Box und –35-Box. Von der Promotor-Stärke hängt die Häufigkeit der Initation, dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Transkription, ab. 3 Eine Sequenz in der Umgebung des Promotors, an die Regulationselemente (Repressoren oder Aktivatoren) binden können, um die Initiation der Transkription zu regulieren.

1.1. Einführung

3

vität), zum anderen den physiologischen Zustand des Wirtsorganismus (Wachstum außerhalb des Arrhenius-Bereichs (s. 2.1.1), ausgeprägte Substratlimitierung). Dazu können Wechselwirkungen zwischen Produkt und Zellen (z. B. metabolic burden (s. 2.1.5), Degradation) treten. Der Interdependenz zwischen Produktqualität und physiologischem Zustand der Wirtszelle gilt das Hauptaugenmerk dieser Arbeit (Abb. 1).

Abb. 1: Einfluß der Prozeßbedingungen auf und Wechselwirkungen zwischen physiologischem Zustand und Produktqualität Online verfügbare Informationen über den physiologischen Zustand können zur Prozeßüberwachung und –regelung genutzt werden. Die Produktqualität ist das Kriterium für die Prozeßoptimierung. Die Kultivierungsbedingungen ändern sich beim Übergang von der Stammentwicklung (Schüttelkolben) in den technischen Prozeß. Ob sich ein genetisches Konstrukt unter Produktionsbedingungen bewährt, hängt vom physiologischen Zustand der Wirtszelle ab. Viele Untersuchungen beschreiben die Auswirkungen einzelner Streßbedingungen (wie kleine Wachstumsrate, hohe Temperatur oder Substratlimitierung) auf den physiologischen Zustand. Die Folgen der simultanen Einwirkung verschiedener Stimuli und die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die Bedingungen im technischen Prozeß muß eigens untersucht werden. Der physiologische Zustand umfaßt metabolische und regulatorische Elemente, d. h. Mengen und Zusammensetzungen der Makromolekülgruppen, Konzentrationen und Flüsse der Metabolite und Regulation der Enzymeaktivitäten und der Genexpression. Modelle, die die Vielzahl der Wechselwirkungen auf mechanistischer Ebene inkorporieren, sind in ihrer Anwendbarkeit eingeschränkt. Ein Beispiel dafür ist das „Cornell-Modell“ der Einzelzelle (Domach et al., 1984). Es wurde für die Besonderheiten kleiner Wachstumsraten (Kim et al., 1987), plasmidtragender Zellen (Peretti et al., 1989; Kim und Shuler, 1990) und starker Fremdproteinsynthese (Laffend und Shuler, 1994) erweitert. Plasmidreplikation wird auf mechanistischer Ebene berücksichtigt (Ataai und Shuler, 1987). Es kann allerdings nur

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1. Einleitung

isotherme Prozesse beschreiben, denn alle Parameter wurden für den Stamm E. coli B/r-A für eine Temperatur von 37°C aus der Literatur entnommen. Für praktische Zwecke benutzt man oft einfache strukturierte Modelle, die eine Anzahl von „Pseudokomponenten“ mit wenigen Parametern korrelieren. Eine umfassende biologische Interpretation ist nicht angebracht. Die Modelle sind aber z. B. für die Prozeßregelung geeignet. Die Schwierigkeit besteht in der zweckgemäßen Auswahl von Komponenten, die die Zelle unter den betrachteten Kultivierungsbedingungen repräsentieren (Bailey, 1993). Für die Prozeßüberwachung bietet sich noch ein anderes Vorgehen an. Bei der Mustererkennung (Pattern recognition) werden die Trajektorien (Zeitverläufe) ausgewählter Strukturvariablen verfolgt. Diese sollten so definiert werden, daß sie sich für physiologische Zustände, die zu einer gemeinsamen Klasse gruppiert werden können, nicht ändern, aber stark auf Wechsel der Zustandklasse reagieren4. Sie sollten physiologisch interpretierbar und mit akzeptabler Zeitverzögerung aus online Meßdaten verfügbar sein (Konstatinov und Yoshida, 1990). Der „physiologische Zustand“ wird also in physiologische Situationen zerlegt, die nacheinander durchlaufen werden. Sie werden erkannt und die jeweils angemessene Regelungsstrategie angewendet (Konstatinov und Yoshida, 1989). Auch hierbei besteht die Schwierigkeit wieder in der Auswahl der den physiologischen Zustand charakterisierenden Strukturvariablen.

4

Beispielsweise zeigt ein plötzlicher Anstieg des Sauerstoffpartialdrucks pO2 den Verbrauch des vorgelegten Substrats und damit das Ende der Batch-Phase an. Ein steiler Anstieg des Verhältnisses der Lauge- zur Glukoseaufnahmerate markiert den Beginn der Acetat-Exkretion.

1.2. Zielsetzung

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1.2 Zielsetzung In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen der Prozeßbedingungen auf und die Wechselwirkungen zwischen Produktqualität von bFGF und physiologischem Zustand von rekombinanten E. coli in Hochzelldichtekultivierungen untersucht. Der Einfluß der Prozeßbedingungen auf die Akkumulation von bFGF wurde durch Variation der Zufütterungsrate in Kultivierungen mit dem bFGF-Produzenten E. coli TG1 pλFGFB ermittelt. Die Zusammenhänge wurden mit einem Modell beschrieben. Die Auswirkungen simultaner Beanspruchung durch mehrere Streßfaktoren auf den physiologischen Zustand unter Produktionsbedingungen wurden in Kontrollkultivierungen mit TG1 pCytexP1, der das parentale Plasmid ohne das bFGF-Gen trägt, ermittelt. Die Kinetik der Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von zelleigenen und Plasmid-kodierten Proteinen wurden aufgenommen, um die relevanten Proteingruppen zu identifizieren, die den physiologischen Zustand charakterisieren. Um die Wechselwirkung zwischen bFGF-Bildung und dem physiologischen Zustand des Bakteriums zu bestimmen, wurden Standardkultivierungen von TG1 pλFGFB mit den Kontrollkultivierungen verglichen. Die Kenntnis der durch bFGF-Synthese hervorgerufenen Veränderungen des physiologischen Zustands sollten erlauben, interne Limitierungen zu identifizieren, die die Akkumulation von löslichem, aktivem bFGF begrenzen. Die den physiologischen Zustand charakterisierenden Größen sollten identifiziert und mit online meßbaren Größen korreliert werden, um den physiologischen Zustand online überwachen zu können.

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2. Theoretische Grundlagen

2 Theoretische Grundlagen 2.1

Einflüsse auf den physiologischen Zustand des Wirtsorganismus

2.1.1 Temperatur Mikroorganismen wachsen unter unlimitierten Bedingungen mit einer maximalen spezifischen Wachstumsrate, die im optimalen Temperaturbereich nach dem Gesetz von Arrhenius (1889) von der Temperatur abhängt. In diesem „Normalbereich“ ist der Logarithmus der Wachstumsrate linear mit dem Reziprok der absoluten Temperatur korreliert (Abb. 2).

Abb. 2: Wachstumsrate und Peptid-Verlängerungsrate als Funktion der Temperatur Offene Symbole: Wachstumsrate, geschlossene Symbole: Peptid-Verlängerungrate (Aminosäuren pro Sekunde). Aus Farewell und Neidhardt (1998) entnommen. Bei höheren oder tieferen Temperaturen fällt die Wachstumsrate progressiv und nähert sich einer vertikalen Asymptote bei der maximalen bzw. minimalen Wachstumstemperatur (Ingraham und Marr, 1996). Der Normalbereich reicht für E. coli von 21°C bis 37°C, die maximale Wachstumstemperatur beträgt 49°C. Für Wildtyp-Stämme ist die Temperatur-Charakteristik vom Medium unabhängig; in Minimalmedium ist die Wachstumsrate niedriger, zeigt aber den gleichen Verlauf. Für K12-Stämme (zu denen der hier verwendete Stamm TG1 zählt) ist das Wachstum bei hohen Temperaturen zwischen 40°C und 45°C aber von der Verfügbarkeit an exogenem Methionin abhängig (Ron und Davis, 1971). Das erste Enzym der MethioninBiosynthese, das MetA-Genprodukt, wird bei hohen Temperaturen reversibel inhibiert (Ron

2.1. Einflüsse auf den physiologischen Zustand des Wirtsorganismus

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und Shani, 1971). Es ist ein Hitzeschockprotein (Ron et al., 1990), das auf der Transkriptionsebene aktiviert wird (Biran et al., 1995). Im Normalbereich ändert sich die Zusammensetzung der Zelle kaum. Nach einem Temperatursprung wird sofort die neue Wachstumsrate angenommen; die Regulation erfolgt auf der Ebene der Enzymaktivität (Neidhardt und VanBogelen, 1987). Ein Sprung zu Temperaturen oberhalb des Arrhenius-Bereichs ist mit erheblichen Veränderungen in der Proteinsynthese verbunden (Lemaux et al., 1978); er ruft die Hitzeschockantwort hervor (s. 2.1.2). Der Hauptunterschied in den Proteinzusammensetzungen bei 37°C und 46°C liegt in der Reduktion der Konzentrationen von Proteinen des Protein-produzierenden Systems (PPS) und der Akkumulation von Hitzeschockproteinen. Der Anteil der Proteine des PPS am Gesamtprotein fällt von 38% auf 22%, der Anteil von drei vorherrschenden Hitzeschockproteinen am Gesamtprotein steigt von 4% auf 20% (Herendeen et al., 1979). Man schätzt, daß die Konzentrationen etwa der Hälfte der Proteine über die veränderte Wachstumsrate reguliert wird (Herendeen et al., 1979), da sie ähnlich reagieren wie bei Variation der Wachstumsrate mit verschiedenen Medien bei 37°C (Pedersen et al., 1978). Die stationären Konzentrationen weniger „Thermometer“-Proteine variieren über den ganzen Bereich linear mit der Temperatur, während sich die Konzentrationen der meisten Proteine innerhalb des Arrhenius-Bereichs nur geringfügig ändern (Herendeen et al., 1979). Im Normalbereich wird die Proteinsyntheseleistung bei gegebener Temperatur durch die Ribosomenmenge pro Zelle als Funktion der Wachstumsrate bestimmt (Keener und Nomura, 1996), während die Peptid-Verlängerungsrate konstant bleibt. Die Veränderung der Wachstumsrate mit der Temperatur wird durch einen anderen Mechanismus bestimmt: die Ribosomenkonzentration bleibt konstant5. Die Peptid-Verlängerungsrate steigt mit der Temperatur wie die Wachstumsrate im Normalbereich (Farewell und Neidhardt, 1998), ebenso die rRNAVerlängerungsrate (Ryals et al., 1982). Bei gegebener Temperatur nimmt die Effizienz der RNA-Synthese (Bildungsgeschwindigkeit bezogen auf DNA-Konzentration) mit der Wachstumsrate zu, die Effizienz der Proteinsynthese (Bildungsgeschwindigkeit bezogen auf die RNA-Konzentration) aber bei hohen Wachstumsraten ab (Chohji et al., 1976). Umgekehrt nimmt bei konstanter Wachstumsrate die RNA-Synthese-Effizienz mit der Temperatur ab, die Protein-Synthese-Effizienz aber zu (Chohji et al., 1976). Wenn also das Substratangebot die

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Konstant bleiben zwischen 20°C und 40°C ferner die Konzentration der RNA-Polymerase pro Zellmasse, der Anteil der RNA-Polymerase, der aktiv an der RNA-Synthese beteiligt ist, die Anteile von rRNA und tRNA an der Zellmasse und der Anteil der Synthese stabiler RNA an der gesamten RNA-Synthese (Ryals et al., 1982).

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2. Theoretische Grundlagen

Wachstumsrate bestimmt, ändert sich die Zahl der Ribosomen pro Zelle, während die Temperatur die Wachstumsrate über die Peptid- und RNA-Verlängerungsrate beeinflußt. Auch über den Normalbereich hinaus bis 44°C nimmt die Peptid-Verlängerungsrate mit der gleichen Aktivierungsenergie (d. h. Steigung im Arrhenius-Diagramm) wie im Normalbereich zu (Farewell und Neidhardt, 1998; s. Abb. 2). Auch wenn die Proteinsynthesegeschwindigkeit schneller steigt als die Wachstumsrate, scheint es dennoch keinen Überschuß an untätigen Ribosomen zu geben. Vielmehr ist gleichzeitig zur Zunahme der Proteinsynthesekapazität die Geschwindigkeit der Proteindegradation erhöht (Farewell und Neidhardt, 1998). Wenn auch die Degradation bei hohen Temperaturen verstärkt ist, reflektiert die Veränderung der Proteinkonzentrationen hauptsächlich Veränderungen in den Bildungsgeschwindigkeiten der Proteine (Herendeen et al., 1979). Mit steigender Temperatur nimmt der Erhaltungsenergiebedarf stark zu, während der extrapolierte maximale Biomasse-Ausbeutekoeffizient (bezogen auf die Stoffmenge des Substrats) konstant bleibt (Wallace und Holms, 1986); der Erhaltungsenergiebedarf beruht also nicht auf einer verringerten ATP-Bildungseffizienz. Der beobachtete Ausbeutekoeffizient verringert sich wegen des erhöhten Erhaltungsenergiebedarf (vgl. Gleichung 1 in Abschnitt 2.1.3). 2.1.2 Streßreaktion Hitzeschockantwort Nach einem Temperatursprung zeigen die differentiellen Protein-Bildungsgeschwindigkeiten (Bildungsgeschwindigkeiten bezogen auf die gesamte Proteinsyntheseleistung) transiente Fluktuationen. Die Extreme werden etwa 10 min nach dem Sprung erreicht; die meisten Proteine erreichen innerhalb von 25 bis 45 min wieder ihre alten Bildungsgeschwindigkeiten (Lemaux et al., 1978). Die Ausprägung der Veränderung ist etwa proportional zur Größe des Temperatursprungs, und eine Temperaturerhöhung bewirkt einen genau entgegengesetzten Effekt wie eine Temperaturerniedrigung. Bei einem Aufwärtssprung werden Proteine des Protein-produzierenden Systems, also ribosomale Proteine, aminoacyl-tRNA-Synthetasen und Elongationsfaktoren, zeitweise reprimiert, während eine damals unbekannte Klasse von Proteinen um Faktoren zwischen 2 und 50 induziert werden (Lemaux et al., 1978). Die meisten dieser Proteine unterliegen der Kontrolle durch einen besonderen Sigma-Faktor6, σ32, der durch das Gen rpoH kodiert wird (Straus et al., 1987). Neidhardt und VanBogelen

6

Sigma-Faktor: die Affinitätsuntereinheit der RNA-Polymerase, die spezifisch bestimmte Promotoren erkennt. Die „Kern“-RNA-Polymerase (α2ββ‘) kann an Enden oder Brüchen der DNA starten; zur Promotorerkennung bindet sie eine Sigma-Untereinheit (Records et al., 1996). Sigma-Faktoren werden durch hochgestellte Ziffern unterschieden, die ihre Molare Masse in kDa angeben. Der „Haushalts-Sigma-Faktor“ ist σ70. Die kleineren Sigma-Faktoren σ54 (Stickstoffstoffwechsel) und σ28 (Flagellensynthese) sind in Konzentration von 10 bzw. 50% des σ70 vorhanden (Jishage et al., 1996).

2.1. Einflüsse auf den physiologischen Zustand des Wirtsorganismus

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(1987) definierten „Hitzeschockproteine“ als solche, die von σ32 reguliert werden. Später wurde jedoch eine zweite Gruppe von Hitzeschockproteinen, die auf exocytoplasmatischen Streß reagieren und durch σ24 reguliert werden, entdeckt. Nachfolgend wurden durch Nachweis von mRNA eine ganze Reihe weiterer Hitzeschockproteine gefunden, von denen nur ein Teil unter der Kontrolle von σ32 steht (Chuang und Blattner, 1993). Die Funktion der meisten Hitzeschockproteine ist noch unverstanden. Die wichtigsten Hitzeschockproteine sind Chaperone, die die Aggregation denaturierter Proteine verhindern, wie das DnaK-DnaJ-GrpESystem oder das GroEL-GroES-System, oder ATP-abhängige Proteasen, wie Lon, FtsH, HslVU und ClpPX (Thomas et al., 1997). Diese werden durch die Konzentration und Aktivität von σ32 kontrolliert (Straus et al., 1987), weshalb hier nur auf dessen Regulationsmechanismen eingegangen wird. Die Regulation der Konzentration und Aktivität des Sigma-Faktors σ32 findet auf verschiedenen Ebenen statt. Die Transkriptionsrate hängt vom Temperatursprung und vom Grad der DNA-Überwindungen ab und ist bei 42°C elffach stärker als bei 30°C (maximal nach 2 – 4 min) (Ueshima et al., 1989). Die Bildungsgeschwindigkeit des Proteins ist aber unter diesen Bedingungen nur doppelt so hoch wie bei 30°C, weil die hauptsächliche Regulation auf Translationsebene stattfindet (Bukau, 1993). Zwei am 5‘-Ende der mRNA im Proteinkodierenden Bereich liegende Sequenzen bilden eine Sekundärstruktur aus, die die Translation der mRNA unter Nicht-Streß-Bedingungen verhindert. Die Lösung der Basenpaarung ist ein früher Schritt der Hitzeschockantwort, aber auch die genaue Sequenz scheint wichtig zu sein, da Mutationen, welche die Basenpaarung aufrechterhalten, die HitzeschockRegulation stören (Yuzawa et al., 1993). Die Konzentration von σ32 wird außerdem durch verschiedene ATP-abhängige Proteasen reguliert (Kanemori et al., 1997). Die Stabilität hängt von der Wechselwirkung mit dem Chaperonsystem DnaKJ (vgl. Anmerkung 9 auf S. 11) ab: bindet DnaKJ an σ32, wird der SigmaFaktor abgebaut (Straus et al., 1990). Durch diese Bindung wird gleichzeitig die Wechselwirkung von σ32 mit der Kern-RNA-Polymerase verhindert, also die Aktivität des Sigma-Faktors vermindert (Abb. 3). Der Sigma-Faktor σ32 durchläuft den gleichen Zyklus von Bindung und Freisetzung wie denaturierte Proteine (s. 2.4.1): DnaJ lenkt DnaK zu σ32 (Liberek et al., 1995), der Austausch von ADP gegen ATP durch GrpE läßt DnaKJ von σ32 dissoziieren (Gamer et al., 1996). Die Bindung an σ32 ist aber (im Gegensatz zu der Bindung an denaturierte Proteine) spezifisch; ein „C-Region“ genannter Bereich ist für die Instabilität von σ32 und das Abschalten der Hitzeschockantwort durch DnaKJ verantwortlich (Nagai et al., 1994).

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2. Theoretische Grundlagen

Abb. 3: Schematische Darstellung der Autoregulation der Hitzeschockantwort DnaK bindet gelenkt von DnaJ an den Sigma-Faktor σ32, verhindert seine Wechselwirkung mit der Kern-RNA-Polymerase und präsentiert ihn zum Abbau durch Proteasen. Außerdem inhibiert DnaKJ die Translation der rpoH-mRNA. Unter Streßbedingungen akkumulierte denaturierte Proteine binden DnaKJ und „titrieren“ es. Die Aktivität und Stabilität von σ32 sowie die Translationsgeschwindigkeit der rpoH-mRNA werden dadurch erhöht. Die Hitzeschock-Gene werden exprimiert, bis genügend DnaKJ zur Repression von σ32 gebildet wurde. Nach Bukau (1993). Nicht nur hohe Temperatur, sondern auch die Akkumulation „abnormaler“ Proteine7 kann die Hitzeschockantwort auslösen (Goff und Goldberg, 1985). Proteolytisch instabile „abnormale“ Proteine, die schnell abgebaut werden, bleiben ohne Einfluß; wenn sie durch N- oder Cterminale Fusionen stabilisiert werden, akkumulieren sie in der unlöslichen Zellfraktion und induzieren die Hitzeschockantwort (Snow und Hipkiss, 1987). Die Konzentration unvollständig gefalteter Proteine, nicht deren Abbau, induziert also die Hitzeschockantwort. Eine Mutante, die leichter denaturiert wird als das entsprechende Wildtyp-Protein, ist ein wirkungsvollerer Induktor (Parsell und Sauer, 1989). Wenn der Export von Proteinen verhindert wird (z. B. durch Mutationen in secA oder secB, die für Teile der Exportmaschinerie kodieren), akkumulieren die Prä-Proteine8 und lösen die Hitzeschockantwort aus (Wild et al., 1993). Die abnormalen Proteine erhöhen die Stabilität, nicht aber die Syntheserate von σ32 (Kanemori et al., 1994). Die Kinetik ist langsamer als die der Temperatur-induzierten Hitzeschockantwort. Erst nach 10 min sind die Bildungsgeschwindigkeiten der Hitzeschockproteine erhöht;

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Gemeint sind Proteine, die durch Einbau von Aminosäure-Analoga oder vorzeitigen Translationsabbruch nicht in der Lage sind, eine stabile Konformation einzunehmen, oder auch überexprimierte oder heterologe Proteine. 8 Zu exportierende Proteine haben eine Signalsequenz, die nach erfolgter Translokation abgespalten wird und in den reifen Proteinen nicht zu finden ist. Das Protein mit Signalsequenz wird als Prä-Protein bezeichnet.

2.1. Einflüsse auf den physiologischen Zustand des Wirtsorganismus

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sie bleiben aber über eine Stunde lang induziert. Erst kürzlich wurde berichtet, daß bei Induktion eines rekombinanten Proteins gleichzeitig zu einem Temperatursprung die Beendigung der Hitzeschockantwort verzögert wird, sogar wenn nur 1500 Moleküle des rekombinanten Proteins pro Zelle akkumulieren (Tomoyasu et al., 1998). Diese Beobachtungen werden durch ein „Titrationsmodell“ beschrieben: unvollständig gefaltete Proteine binden an DnaKJ9 und entziehen es dadurch der Wechselwirkung mit σ32, wodurch dieses stabilisiert und aktiviert wird. Die Hitzeschockgene werden transkribiert, bis ausreichend DnaKJ gebildet ist, um sowohl die unvollständig gefalteten Proteine als auch σ32 zu binden und die Hitzeschockantwort abzuschalten (Abb. 3). Der Zyklus von Assoziation und Dissoziation von DnaKJ verhindert auch die Aggregation unvollständig gefalteter Proteine, wie im Zusammenhang mit der Proteinfaltung beschrieben (s. 2.4.1). Stabile Komplexe werden gebildet, wenn die Ablösung des DnaK vom ungefalteten Protein nicht gelingt (Thomas und Baneyx, 1996b). Daher werden Chaperone wie DnaK auch in Einschlußkörpern (s. 2.3) gefunden. Sie können die Einschlußkörper allerdings nicht resolubilisieren. In vitro werden stabile Komplexe zwischen DnaK und Proteinen in Abwesenheit von ATP gebildet, was zur Aufreinigung genutzt wird: DnaK wird bei der Affinitätschromatographie mit ATP eluiert (Sherman und Goldberg, 1991). Ein weiteres Schicksal stabiler DnaK-Protein-Komplexe in vivo ist die Degradation (Sherman und Goldberg, 1992). In E. coli sind mindestens 24 Proteasen oder Peptidasen bekannt, von denen 20 durch σ32 kontrolliert werden (zitiert nach Harcum und Bentley, 1993). Die meisten Hitzeschock-induzierten Proteasen sind ATP-abhängig; dazu gehören Lon, ClpPX, FtsH und HslVU (Thomas et al., 1997). Die aktivste Protease ist Lon; in lon—-Zellen werden abnormale Proteine hauptsächlich durch ClpPX abgebaut (Gross, 1996). Darin ist ClpP die ProteolyseUntereinheit, die mit verschiedenen ATPase-Untereinheiten wechselwirken kann, und ClpX die Hitzeschock-induzierte ATPase-Untereinheit, welche die Spezifität für das Substrat bestimmt (Wawrzynow et al., 1995). HslVU ist eine Protease mit breitem Substratspektrum und komplexer Struktur: sie ist ein Dimer von Hexameren. Lon- und Clp-Proteasen sind prozessiv, d. h. sie setzen keine Bruchstücke frei. Andere Proteasen spalten kleine Bruchstücke ab; dies beeinträchtigt nicht immer die Aktivität des Proteins, kann aber je nach geplanter Anwendung – z. B. als Therapeutikum – nicht toleriert werden (Enfors, 1992).

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Bukau (1993; Mayer und Bukau, 1998) betont, daß DnaK zwar eine Affinität zu hydrophoben Aminosäuren hat, die Bindung aber zu schwach ist für eine effektive Chaperonwirkung. Zu bindende Proteine werden durch DnaJ erkannt und zu DnaK überführt. Weil sowohl DnaK als auch DnaJ „titriert“ werden, wird im weiteren von DnaKJ geschrieben werden.

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2. Theoretische Grundlagen

Die durch die Hitzeschockantwort verursachte proteolytische Aktivität kann auch andere Streßantworten beeinflussen: der Sigma-Faktor σ38, der die Gene für die stationäre Phase („Hungerantwort“, s. 2.1.4) kontrolliert, wird durch ClpPX (nicht aber durch Lon) abgebaut (Schweder et al., 1996). Andererseits stabilisiert DnaK den Faktor σ38, wodurch ein Teil der Hungerantwort unter Hitzeschock-Bedingungen ausgelöst wird (während ein anderer Teil zusätzliche Signale benötigt, Muffler et al., 1997). 2.1.3 Substratlimitierung und Regulation der Stoffflüsse Die Hochzelldichtekultivierung ist ein Fed-Batch-Verfahren, bei dem durch limitierte Zufütterung der Kohlenstoffquelle hohe Zelldichten erreicht werden. Die Limitierung bedingt submaximale Wachstumsraten und kann Konsequenzen für den physiologischen Zustand haben. Die zur Deckung des Erhaltungsenergiebedarfs verbrauchte Substratmenge pro Zeiteinheit m′S ist bei gegebener Temperatur konstant, während die zur Biomasse-Bildung benutzte Substratmenge mit dem „wahren“ Ausbeutekoeffizienten YX′ S von der Wachstumsrate abhängt (µ/ YX′ S ). Mit fallender Wachstumsrate nimmt das Verhältnis von mS′ zu µ/ YX′ S zu. In kontinuierlicher Kultur führt dies zu verringerter Zelldichte bei kleinen Durchflußraten. Während der Fed-Batch-Phase mit reduzierter Wachstumsrate findet man entsprechend kleine beobachtete Ausbeutekoeffizienten YX S

YX S =

µ ⋅ YX′ S . µ + mS′ ⋅ YX′ S

(1)

Wichtig wird der Effekt besonders nach dem Temperatursprung zur Induktion des rekombinanten Proteins, da der Erhaltungsenergiebedarf steil mit der Temperatur ansteigt. Die Konzentration des Signalmoleküls ppGpp, das die stringente Antwort (s. 2.1.6) reguliert, ist im Fed-Batch größer als in Satzkultivierung. Wenn eine kritische Wachstumsrate von 0,06 h-1 unterschritten wird, steigt die ppGpp-Konzentration nochmals deutlich an (Andersson et al., 1996b). Die stringente Antwort ist mit einem Anstieg des Erhaltungsenergiebedarfs verbunden: dieser wird eine nicht-lineare Funktion der Wachstumsrate (vanVersefeld et al., 1986). Außerdem können Sauerstoffaufnahme- und Kohlendioxidbildungsrate steil abfallen und Proteine im zellfreien Kulturüberstand gefunden werden (Andersson et al., 1996a). Die Zahl Kolonie-bildender Zellen pro Kulturvolumen bleibt nach der Temperatur-induzierten Bildung eines rekombinanten Proteins konstant, wenn die Wachstumsrate vor Induktion über einem kritischen Wert von 0,2 h-1 gelegen hat; andernfalls fällt sie ab (Ryan et al., 1996). Zellen mit höherer Wachstumsrate vor Induktion können sich besser an Streß anpassen, wo-

2.1. Einflüsse auf den physiologischen Zustand des Wirtsorganismus

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gegen bei kleiner Wachstumsrate kultivierte Zellen leicht ihre Vitalität verlieren10. Die Vitalität bestimmt die Produktivität entscheidend. Borth et al. (1998) maßen den Gehalt an DNA (als Maß für die Zellteilung), an RNA (Proteinsyntheseaktivität) und Protein (Zellgröße), außerdem die Konzentration eines rekombinanten Proteins als Maß für die Produktivität. Zellen, die ihre Biomasse nach Induktion vermehrten, zeigten auch die höchsten Produktionsraten. Die Zellen teilten sich aber nicht, sondern vergrößerten sich vielmehr (Borth et al., 1998). Bei kleiner Wachstumsrate außerhalb des balancierten Wachstums nehmen Zellzahl und Biomasse nicht in gleicher Weise zu (Ryan et al., 1996). Bei hohen Zelldichten kann der Kohlendioxidpartialdruck ansteigen. Über 0,3 bar inhibiert CO2 das Wachstum (Pan et al., 1987) und kann Acetat-Exkretion stimulieren (Lee, 1996). Acetat inhibiert ebenfalls das Wachstum (z. B. Han et al., 1992). Kritisch für den Erfolg von Hochzelldichtekultivierungen ist daher die Entfernung gebildeten Acetats (Lee et al., 1989; Shimizu et al., 1992) oder besser die Vermeidung seiner Entstehung. Einige Konsequenzen der Substratlimitierung sind durch Regulation oberhalb der Operonebene vermittelt (dargestellt nach Informationen aus Saier et al., 1996). Zwei wichtige Regulons werden unterschieden: das eine wird von CRP (cAMP receptor protein) kontrolliert, das andere von FruR. Beide Regulatoren können sowohl positiv als auch negativ kontrollieren. Sie werden unter Kohlenstoffmangel-Bedingungen aktiviert. CRP erlaubt die Bildung von Proteinen, deren Funktion die Verwertung alternativer Substrate ist; dazu gehören z. B. Transportproteine und Enzyme, die alternative Substrate in Metabolite der zentralen Stoffwechselwege überführen. FruR steuert die Richtung des Kohlenstoffflusses: es reprimiert die Gene für Enzyme der Glykolyse und des Entner-Doudoroff-Weges, aktiviert dagegen die Gene für Enzyme der Glukoneogenese, des Glyoxylat-Nebenweges und des Tricarbonsäurezyklus. Beide Regulons umfassen Gene des Tricarbonsäurezyklus; bei cAMP/CRP-Kontrolle wird er als kataboler Weg zur Endoxidation des Substrats unter aeroben Bedingungen gebraucht, bei FruR-Kontrolle als anabole Zuführung zur Glukoneogenese. CRP reguliert die Transkription, indem es an spezifische DNA-Sequenzen bindet und die DNA biegt. Dies fördert die Transkription im allgemeinen, weil es die Bildung des offenen Komplexes11 erleichtert, und ermöglicht speziell die korrekte Ausbildung von Protein-

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Zellen in der stationären Phase, die gar nicht mehr wachsen, sind durch die Hungerantwort schon präventiv gegen Streß stabilisiert. 11 Zur Initiation der Transkription muß die Basenpaarung der DNA gelöst werden, um eine Einzelstrang-DNA als Vorlage für die zu synthetisierende mRNA zu schaffen. Dies passiert über die partielle Aufwindung der negativen Superwindungen. Zusammen mit den diesen Zustand stabilisierenden Proteinen wird die entstehende Transkriptionsblase als „offener Komplex“ bezeichnet.

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2. Theoretische Grundlagen

Protein-Wechselwirkungen im Transkriptionskomplex. Das mit CRP wechselwirkende Protein entscheidet über positive oder negative Wirkung auf die Transkription. So beschleunigt die kooperative DNA-Bindung von CRP und RNA-Polymerase die Transkription. CRP ist ein Dimer und wird bei der Bindung eines oder zweier Moleküle cAMP (2‘,3‘cyclisches Adenosine-Monophosphate) durch eine Konformationsänderung aktiviert. Die intrazelluläre cAMP-Konzentration wird über zwei Mechanismen bestimmt: die Aktivität der Adenylat-Zyklase, die die Bildung von cAMP katalysiert, und den Ausfluß von cAMP. Die Adenylat-Zyklase wird durch phosphoryliertes IIAGlc des Phosphotransferase-Systems12 allosterisch aktiviert. Für den Ausfluß von cAMP aus dem Cytoplasma ins Medium wird das Membranpotential, das aufgebaut wird, wenn genügend Energie verfügbar ist, benötigt. Die intrazelluläre Konzentration an cAMP steigt also, wenn keine Glukose aus dem Medium aufgenommen und bei Energiemangel das Membranpotential nicht aufrechterhalten wird. CRP steht unter positiver Autoregulation. Bei kleiner cAMP-Konzentration reprimiert CRP seine eigene Synthese, bei hoher cAMP-Konzentration fördert es sie. Bei Glukosemangel erfolgt also eine schnelle Reaktion über den Anstieg der Konzentration von cAMP und eine langsame Verstärkung der Antwort über die Konzentration an CRP. FruR verliert durch die Bindung von phosphorylierter Fruktose (Fruktose-1-Phosphat oder Fruktose-1,6-Bisphosphat) seine Affinität zur DNA. Bei Verfügbarkeit von verwertbaren Zuckern werden also Enzyme der Glykolyse und des Entner-Doudoroff-Weges induziert, die der Glukoneogenese, des Glyoxylat-Nebenweges und des Tricarbonsäurezyklus reprimiert. Mangel an Biomasse-Bausteinen dagegen induziert den oxidativen und glukoneogenetischen Kohlenstofffluß und reprimiert den Glukoseabbau. Bei Eintritt in die stationäre Phase wird die Expression von fruR über einen noch unbekannten Mechanismus verstärkt. 2.1.4 Streßreaktion Hungerantwort Die Hungerantwort verläuft in zwei Stufen: zunächst wird bei Substratmangel das durch cAMP/CRP kontrollierte Regulon aktiviert. Die Zelle versucht, sich neue Substrate zu erschließen oder in eine günstigere Umgebung zu flüchteten (z. B. gehören auch die Flagellenund Chemotaxis-Operons zu diesem Regulon). Als ultima ratio bereitet sich die Zelle auf den Übergang in einen anderen physiologischen Zustand, die „stationäre Phase“, vor. Hier steht

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Das Phosphotransferase-System (PTS) katalysiert die Aufnahme bestimmter Zucker. Es besteht aus einem membrangebundene Protein IIC, das spezifisch Zucker aufnimmt und dabei durch das Übertragung eines Phosphatrest von IIB phosphoryliert. Der Phosphatrest stammt von Phosphoenolpyruvat und wird über eine Kette von Proteinen (I und HPr, die allen PTS gemeinsam sind, und einem Zucker-spezifischen Protein IIA) auf an IIC gebundenes IIB übertragen. Das Auftreten phosphorylierten IIAs zeigt an, daß der entsprechende Zucker nicht im Medium vorhanden ist.

2.1. Einflüsse auf den physiologischen Zustand des Wirtsorganismus

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der Schutz der Makromoleküle unter Streßbedingungen im Vordergrund, ähnlich wie bei der Hitzeschockantwort. Tatsächlich werden Teile der Hitzeschockantwort auch beim Übergang in die stationäre Phase induziert, wie andererseits z. B. oxidativer oder osmotischer Streß die Hungerantwort auslöst. Diese eigentliche Hungerantwort wird durch den Sigma-Faktor σ38 kontrolliert. Interessant ist, daß diese Antwort durch cAMP/CRP reprimiert wird: die Zelle vermeidet die stationäre Phase, solange nicht alle anderen Möglichkeiten13 ausgenutzt sind. Die Zellen schalten in der stationären Phase von Wachstum und Zellteilung auf Erhaltungsstoffwechsel und Zellerhaltung um. Dieser Übergang ist nicht plötzlich, vielmehr zeigt die Expression mancher Gene eine inverse Korrelation zu Wachstumsrate und wird schon bei langsamem Wachstum partiell induziert (Hengge-Aronis (1996), woraus auch die folgenden Informationen entnommen sind). Eine Reihe von Proteinen, die dem Schutz von Proteinen, Membranen und DNA und zur DNA-Reparatur dienen, wird gebildet. Diese stehen unter der Kontrolle des Sigma-Faktors σ38 (auch σS, RpoS, KatF oder AppR genannt). Die Konzentration von σ38 ist wie die von σ32 auf drei Ebenen reguliert. Die Transkription wird bei Verbrauch der Substrate verstärkt. Einige niedermolekulare Verbindungen wie Homoserin-Lakton oder Acetat induzieren die Transkription von σ38, während cAMP/CRP reprimiert. Die Translation wird wie die von σ32 über Basenpaarung der mRNA reguliert; σ38 hat indirekt (über ein Protein unter seiner Kontrolle) einen negativen Einfluß auf seine Translation. σ38 ist ein sehr instabiles Protein; dabei ist UDP-Glukose ein negativer Regulator der Stabilität von σ38. Bei Glukosemangel verlängert sich die Halbwertszeit deutlich. Dies hat den größten Effekt auf die Konzentration von σ38. Die Konzentration von σ38 folgt der des Signalmoleküls14 ppGpp. Der Mechanismus ist unbekannt. Die Auswirkungen des Substratmangels sind komplex. Erstens wirkt σ38 auf die Transkription von Regulatorproteinen, von denen einzelne entweder auch von anderen Streßarten (Osmotischer Schock, Anaerobiosis) induziert werden oder durch andere Regulatorproteine ersetzt werden können15. Zweitens gibt es Querregulationen zwischen den Regulons, so reprimiert cAMP/CRP die Transkription von rpoS, Lrp modifiziert die Transkription σ38-abhängiger Gene. Drittens gibt es eine Reihe anderer Regulons, die bei Substratmangel induziert werden, neben den beschriebenen Systemen CRP und FruR z. B. SspA, das die ppGpp-kontrollierte,

13 Bei Stickstoff- oder Phosphatmangel werden zunächst die durch NtrB/NtrC/σ54 bzw. PhoB/PhoR kontrollierten Regulons aktiviert. 14 Das Signalmolekül ppGpp akkumuliert bei Mangel an Aminosäuren, Kohlenstoff, Stickstoff oder Phosphat und allgemein bei kleinen Wachstumsraten, vgl. 2.1.6. 15 Beispielsweise wird das Gen dps durch σ38 in Verbindung mit dem Regulatorprotein IHF oder durch σ70 zusammen mit OxyR exprimiert

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2. Theoretische Grundlagen

σ38-unabhängige Transkription einiger Gene der stationären Phase vermittelt, oder Lrp, das die Veränderungen nach einem Nährstoff-Entzug16 reguliert. Viertens erlauben bzw. erfordern die Promotor-Regionen von Genen der stationären Phase die Bindung mehrerer Transkriptionsfaktoren wie H-NS, IHF oder Lrp. Diese komplexe Architektur erinnert an den modularen Aufbau von eukaryontischen Promotor-Regionen (Hengge-Aronis, 1996). 2.1.5 Einfluß von Plasmidpräsenz und Synthese Plasmid-kodierter Proteine Vom makroskopischen Standpunkt wird die Wirkung von Plasmiden auf die Physiologie des Wirtsorganismus der „Stoffwechsellast“ zugeschrieben, die als Anteil der Wirtsressourcen für die Erhaltung und Expression von Fremd-DNA definiert wird (Glick, 1995). Der Energieverbrauch zur Plasmidreplikation ist – verglichen mit dem Aufwand zur Expression der Fremd-DNA, d. h. der Synthese der Plasmid-kodierten Proteine – gering, wie der theoretische Ausbeutekoeffizient bezogen auf ATP, YX/ATP, (Anderson Da Silva und Bailey, 1986) sowie der gemessene Ausbeutekoeffizient YX S (Andersson et al., 1996b) zeigen. Da Plasmide aber konstitutiv exprimierte Resistenzmarker tragen, fällt die Wachstumsrate linear mit der Konzentration an Plasmid-kodiertem Protein (z. B. Chloramphenicol-AcetylTransferase und β-Laktamase, Bentley et al., 1990). Nach der Induktion des rekombinanten Zielproteins fallen sowohl der theoretische Ausbeutekoeffizient YX/ATP als auch der gemessene Ausbeutekoeffizient YX S stark (Anderson Da Silva und Bailey, 1986; Andersson et al., 1996b). Wird die spezifische Bildungsgeschwindigkeit eines rekombinanten Proteins z. B. durch N-terminale Fusion von drei bis vier Aminosäuren variiert, ist die Wachstumsrate produzierender Zellen bezogen auf die Wachstumsrate plasmidfreier Zellen umgekehrt proportional zur Bildungsgeschwindigkeit des rekombinanten Proteins (Jensen und Carlsen, 1990). Allerdings scheint nicht der „wahre“ Ausbeutekoeffizient verändert zu werden; die Abweichungen lassen sich vielmehr mit einem erhöhten Energiebedarf für nicht-wachstumsgekoppelte Prozesse beschreiben (Bhattacharya und Dubey, 1995). Durch den Plasmid-verursachten Energieverbrauch werden als erstes stark energieabhängige Prozesse wie N2-Fixierung oder Bildung von Siderophoren gestört (Glick, 1995). Insbesondere große oder mit hoher Zahl pro Zelle vorliegende Plasmide verursachen eine Verringerung der Wachstumsrate und der auf die Gendosis bezogenen Bildungsgeschwindigkeit des rekombinanten Proteins (Glick, 1995). Auf mechanistischer Ebene kann dies auf die Bindung wirtseigener Proteine, z. B. für DNA-Replikation oder RNA-Polymerisation, durch

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Bei Überführung der Bakterien auf Minimalmedium oder Verbrauch des Vollmediums werden Proteine, die Substraten aus Vollmedium aufnehmen und metabolisieren, reprimiert und biosynthetische Enzyme induziert.

2.1. Einflüsse auf den physiologischen Zustand des Wirtsorganismus

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das Plasmid zurückgeführt werden. Theoretisch kann die RNA-Polymerase die Transkription limitieren17 (Bailey, 1993). Mit steigender Plasmidkopienzahl wird auch die Degradation von RNA beschleunigt. Die Konzentration von rRNA und die Zahl der Ribosomen pro Zelle fällt und erklärt die verringerte Wachstumsrate (Bailey, 1993). Der Zellzyklus wird bei hohen Plasmidkopienzahlen allerdings beschleunigt (Bailey, 1993). Es wird diskutiert, daß Aminosäuren oder aminoacyl-tRNAs, die seltene Codons erkennen, limitieren können. Tatsächlich wirkt sich in manchen Fällen die Zugabe von Aminosäuren positiv auf die Akkumulation des rekombinanten Proteins aus (Harcum et al., 1992; Ramirez und Bentley, 1993). Die Reduktion der Bildung zelleigener Proteine ist aber nicht durch aminoacyl-tRNAs, sondern durch den Mangel an freien Ribosomen limitiert (Vind et al., 1993). Dieser verschärft sich, wenn die Produktion des rekombinanten Proteins den Abbau der rRNA und Zerstörung der Ribosomen verursacht (Dong et al., 1995). Wenn die Faltung des rekombinanten Proteins gestört ist, akkumuliert es in Einschlußkörpern (s. 2.3) und löst die Hitzeschockantwort aus (Goff und Goldberg, 1985; Snow und Hipkiss, 1987; Dong et al., 1995; s. 2.1.2). Dies führt oft zu verlängerten Zellen oder Wachstum in Ketten (Glick, 1995). Das Fremdprotein entzieht den zelleigenen Proteinen die Faltungshelfer (molekulare Chaperone) (Bailey, 1993). Daneben kann das Fremdprotein für die Wirtszelle aufgrund seiner Aktivität toxisch sein. Nach Induktion mancher Proteine findet man eine Verringerung der Anzahl Koloniebildender Zellen und Auftreten von extrazellulärem Protein, woraus die Autoren auf Zelllyse schließen (Andersson et al., 1996b). Häufig findet man bei der Überexpression eines periplasmatischen Proteins, daß alle periplasmatischen Proteine ins Medium verloren werden (Georgiou et al., 1988). Diese „Überproduktionssterblichkeit“ resultiert in einer Konkurrenz rekombinanter und zellulärer Proteine um die Exportstellen (Bailey, 1993; Glick, 1995). Im Ergebnis wird die Äußere Membran durchlässig, und es kommt zum Verlust periplasmatischer Proteine (Bailey, 1993). 2.1.6 Streßreaktion stringente Antwort Die Arbeitsgruppe um Bentley (Harcum et al., 1992; Ramirez und Bentley, 1993) postuliert, daß bei der Produktion rekombinanter Proteine die Verfügbarkeit von Aminosäuren limitiert ist und die stringente Antwort ausgelöst werden kann.

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Die RNA-Polymerase kann DNA unspezifisch binden. Bei hoher Plasmidkopienzahl wird die RNAPolymerase durch unspezifische DNA von den Promotoren „wegtitriert“. Dazu müßte ein 4 kb großes Plasmid allerdings mit der praktisch nicht erreichten Plasmidkopienzahl von 1000 pro Zelle vorliegen.

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2. Theoretische Grundlagen

Die stringente Antwort (hier nach Cahel et al. (1996) dargestellt) tritt auf, wenn die Beladung der tRNAs (d. h. die Aminoacylierung) hinter dem Verbrauch durch Proteinsynthese zurückbleibt. Viele der Effekte scheinen durch die niedermolekulare Verbindung ppGpp18 oder sein Analog pppGpp vermittelt zu werden. Zwei Aktivitäten sind an der Regulation der (p)ppGppKonzentration beteiligt: die Synthetase RelA und die Degradase SpoT. Die RelA-Aktivität ist über das Protein L11 an die Ribosomen assoziiert und überträgt die β,γ-Phosphate von ATP auf GDP oder GTP19. Sie benötigt eine ungeladene tRNA als Cofaktor. Wenn die Elongation an Ribosomen stoppt, weil kein Ternärer Komplex20 bindet, kann eine ungeladene tRNA binden und die ppGpp-Synthese auslösen. Die (p)ppGpp-Akkumulation kann auch durch Nährstofflimitierung oder anderen Streß hervorgerufen werden. Bei Energiemangel wird SpoT inhibiert. Die Konzentration von ppGpp ist invers mit der Wachstumsrate korreliert. Kleine Wachstumsraten können die stringente Antwort auslösen. Die stringente Antwort unterbindet die Akkumulation von stabiler RNA (tRNA und rRNA). Bei der stringenten Antwort werden Gene für Proteine des Protein-produzierenden Systems (ribosomale Proteine, Elongationsfaktoren, RNA-Polymerase) reprimiert. Eine Ausnahme bilden rpoS und rpoH, die die Streß-Sigma-Faktoren σ38 und σ32 kodieren: sie werden aktiviert. Auch Gene für Enzyme für die Aminosäure-Biosynthese werden induziert. Die Inhibierung der RNA-Synthese kann auch negative Auswirkungen auf die Plasmidreplikation haben (Hecker et al., 1983), denn die Plasmidreplikation wird von RNAs kontrolliert (vgl. Anmerkung 53 auf Seite 73). 2.2

Einfluß der Prozeßbedingungen auf die Produktion rekombinanter Proteine Die Temperatur beeinflußt die korrekte Faltung von Proteinen wesentlich (s. 2.3) und ist damit ein wichtiges Kriterium bei der Produktion rekombinanter Proteine. Die Induktion eines rekombinanten Proteins, das bei niedriger Temperatur stabil produziert wird, kann bei hoher Temperatur Zelllyse hervorrufen (Chalmers et al., 1990), vermutlich wegen der Aggregation des Proteins. Für Temperatur-induzierte Systeme gibt es eine optimale Induktionstemperatur: zu niedrige Temperatur induziert unvollständig, zu hohe Temperatur schädigt die Zellen. Die optimale

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(p)ppGpp: Guanosin-3’,5’-bis(diphosphat) bzw. das GTP-Analog pppGpp Die Affinitätskonstante Km ist 0,5 mM für GTP und GDP. Das ist die physiologische Konzentration für GTP, während die GDP-Konzentration deutlich niedriger liegt. GTP ist also das Hauptsubstrat von RelA. Ndk phosphoryliert GDP zu GTP und stellt das Hauptsubstrat für RelA wieder her. 20 Bei der Translation treten die Aminoacyl-tRNAs als Ternärer Komplex mit EF-Tu und GTP in die Ribosomen ein. Bei Einbau der Aminosäure in das nascente Peptid wird GTP zu GDP hydrolysiert. EF-Ts katalysiert den Austausch des GDP gegen ein GTP im dissoziierten EF-Tu.GDP-Komplex. 19

2.2. Einfluß der Prozeßbedingungen auf die Produktion rekombinanter Proteine

19

Temperatur hängt vom herzustellenden Protein ab (Okita et al., 1989). Für kontinuierliche Kultivierungen kann es im Interesse der Kulturstabilität erwünscht sein, submaximal zu induzieren (Villaverde et al., 1993), denn hohe Temperatur kann die Plasmidstabilität verringern (Friehs und Reardon, 1993), wenn sie auch die Plasmidkopienzahl zunächst erhöht (Fieschko und Ritch, 1986). Bei höheren Temperaturen verläuft die Proteinproduktion schneller, läßt aber bald nach, während bei niedrigen Temperaturen eine langsamere Produktion nachhaltiger erfolgt (Surek et al., 1991)21. Kopetzki et al. (1989) berichten, daß eine bei niedrigerer Temperatur kleinere Wachstumsrate sich günstig auf die Proteinproduktion auswirkt. Die Wachstumsrate verursacht zwei gegenläufige Trends der Bildung rekombinanter Proteine. Zum einen vergrößert eine höhere Wachstumsrate den Ribosomenanteil der Zelle und geht mit schnellerer Proteinsynthese und besserer Vitalität einher. So finden Curless et al. (1989) eine maximale volumetrische Lymphokin-Syntheserate nahe bei der maximalen Verdünnungsrate. In Hochzelldichtekultivierungen von E. coli ist die Produktion für zwei rekombinanter Proteine streng wachstumsabhängig, was die Autoren auf den mit steigender Wachstumsrate erhöhten Ribosomenanteil der Zelle zurückführen (Shin et al., 1998). Zum anderen sinkt die Plasmidkopienzahl mit steigender Wachstumsrate bzw. in kontinuierlicher Kultur mit steigender Durchflußrate (Seo und Bailey, 1986). Daher wird in kontinuierlichen Kultivierungen häufig beobachtet, daß die Ausbeute höher ist, je kleiner die Verdünnungsrate gewählt wurde (vier Zitate in Turner et al., 1994). Wenn beide Effekte (größere Plasmidkopienzahl und kleinerer Ribosomenanteil bei kleinen Wachstumsraten) wirksam sind, bekommt man eine maximale Produktion bei mittleren Wachstums- bzw. Verdünnungsraten (Seo und Bailey, 1986; Park et al., 1990; Fu et al., 1993; Turner et al., 1994). Dies wird von Guthke et al. (1990) empirisch durch eine quadratische Relation zwischen Wachstumsrate und Produktbildungsgeschwindigkeit wiedergegeben. Allgemein wurde für diesen Zusammenhang eine empirische Korrelation eingeführt (Lee et al., 1985), die zu einer linearen Abhängigkeit vereinfacht Verbreitung fand (Betenbaugh und Dhurjati, 1990; Korte et al., 1991). Eine ähnliche Beziehung ergibt sich in strukturierten Modellen unter bestimmten Annahmen22. Oft wird direkt die empirische Leudeking-Piret-Gleichung (Leudeking und Pi-

21

Daß eine schnellere Produktion nach kürzerer Zeit aufhört, findet man auch, wenn man Satz- mit Fed-BatchKultivierungen vergleicht (Strandberg et al., 1994). 22 Nämlich wenn diese Modelle a) einen Monod-Ansatz für den Substratbedarf der Produktion des rekombinanten Proteins ansetzen (Cockshott und Bogle, 1992; Hardjito et al., 1992; Lee und Ramirez, 1992; Tartakovsky et al., 1995) oder b) eine gleichartige Abhängigkeit der Produktion des rekombinanten Proteins und der Synthese chromosomal-kodierter Proteine (d. i. des Wachstums) von der Ribosomenverfügbarkeit postulieren (Laffend und Shuler, 1994).

20

2. Theoretische Grundlagen

ret, 1959) benutzt (Reinikainen et al., 1987; Curless et al., 1989; Korus et al., 1991), die die Bildungsgeschwindigkeit in einen Wachstums- und einen Biomasse-abhängigen Teil aufteilt. Diese Ansätze berücksichtigen aber weder die steigende Plasmidkopienzahl noch die sinkende Zahl Kolonie-bildender Zellen bei kleinerer Wachstumsrate und sind für die Beschreibung der Produktion rekombinanter Proteine bei kleinen Wachstumsraten nur beschränkt geeignet. Die Wachstumsrate vor der Induktion hat zwischen µ = 0,2 h-1 und 0,5 h-1 keinen Einfluß auf die stationäre spezifische Konzentration eines rekombinanten Malaria-Antigens in Hochzelldichtekultivierungen von E. coli (Zabriskie et al.; 1987). In kontinuierlicher Kultur tritt für Verdünnungsraten zwischen D = 0,038 h-1 und 0,2 h-1 ein Maximum an sekretiertem GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor) bei D = 0,13 h-1 auf (Curless et al., 1994). Die Autoren vermuten, die Bildungsgeschwindigkeit nehme linear mit der Verdünnungsrate vor Induktion zu, die erzielte Menge sei aber durch Prozessierung und Sezernierung limitiert. Zwei Nebenaspekte betreffen die Stabilität der Produktion und die Faltung des rekombinanten Proteins. Im Fed-Batch ist die Bildungsgeschwindigkeit eines rekombinanten Proteins kleiner als in Satzkultivierung, die Produktion hält aber länger an (Strandberg et al., 1994). Es wurde nicht spezifiziert, ob dies auf die schädigende Wirkung starker Fremdgen-Expression auf den Wirt oder auf die Zunahme an plasmidfreien Zellen zurückzuführen ist. Die Plasmidstabilität verringert sich mit hoher Plasmidkopienzahl, da der Unterschied in der Wachstumsrate zwischen plasmidtragenden und -freien Zellen größer wird (Friehs und Reardon, 1993). Die Hauptursache ist die konstitutive Bildung Plasmid-kodierter Proteine (Resistenzmarker) (Bentley et al., 1990). Bei den kleinen Wachstumsraten im Fed-Batch scheint segregationale Plasmidinstabilität23 eine geringere Rolle zu spielen (Andersson et al., 1996b). Indes kann Kohlenstoff-Limitierung die strukturelle Instabilität erhöhen (Friehs und Reardon, 1993). Bei kleiner Wachstumsrate verbraucht die Zelle einen Großteil des zugefütterten Substrates zur Deckung des Erhaltungsenergiebedarfs, was die Energieverfügbarkeit verringert. Für ein Fusionsprotein wurden im Fed-Batch spezifische Wachstumsraten zwischen 0,07 h-1 und 0,17 h-1 untersucht. Da sich die Konzentration des rekombinanten Proteins nur wenig änderte, die Aktivität aber ein ausgeprägtes Maximum bei 0,13 h-1 aufwies, wurde dies dem unterschiedlichen Ausmaß an korrekter Faltung des Proteins in Abhängigkeit von der Wachstumsrate zugeschrieben (Hellmuth et al., 1994).

23

Segregationale Instabilität verursacht das Auftreten plasmidfreier Zellen. Strukturelle Instabilität bezieht sich auf Umorganisation der Plasmid-DNA, so daß die Gene nicht mehr exprimiert werden können.

2.3. Einschlußkörper als Nebenprodukt der Proteinfaltung

21

2.3 Einschlußkörper als Nebenprodukt der Proteinfaltung Einschlußkörper, die auch „inclusion bodies“ oder wegen ihrer Lichtbrechung „refractile bodies“ genannt werden, sind Partikel, die sich im Lichtmikroskop erkennen lassen und im Elektronenmikroskop als dichte Strukturen erscheinen (Abb. 4). Entsprechend erhöht sich das Verhältnis von Optischer Dichte zur Biomasse und zur Zellzahl bei Einschlußkörper-Bildung (Hwang und Feldberg, 1990).

Abb. 4: Escherichia coli-Zelle mit Einschlußkörpern Die dichte Struktur der Einschlußkörper läßt sie im elektronenmikroskopischen Bild als dunkle Flächen erscheinen. Zu erkennen ist auch der periplasmatische Raum zwischen Äußerer und Innerer Membran. Elektronenmikroskopische Aufnahme aus Spektrum der Wissenschaft (1997), Spezial 6, Pharmazeutische Forschung. Einschlußkörper sind dichte Strukturen in dem Sinne, daß sie eine hohe Masse pro Volumen aufweisen; sie sind aber gleichzeitig sehr porös mit einem Hohlraumvolumen von 70 – 85% (Taylor et al., 1986). Zellen, die Einschlußkörper bilden, haben eine höhere Dichte als Kontrollzellen (Cheng, 1983; Hwang, 1996). Durch ihre hohe Dichte lassen sich Einschlußkörper leicht von den übrigen Zellbestandteilen trennen. Einschlußkörper bestehen zu 95% aus Protein (De Bernardez-Clark und Georgiou, 1991), größtenteils dem rekombinanten oder überexprimierten Protein. Die Verunreinigung durch andere Proteine und die Morphologie der Einschlußkörper (regelmäßig oder amorph) hängen von der Lokalisation der Einschlußkörper (Bowden et al., 1991) und von der Temperatur (Chalmers et al., 1990) ab. Die Anwesenheit von Membranproteinen in Einschlußkörpern wird auf die Kopräzipitation von Zellbruchstükken während der Aufarbeitung zurückgeführt (Rinas und Bailey, 1992). Man findet daneben Proteine, deren Export oder Faltung von Chaperonen abhängt, in cytoplasmatischen Ein-

22

2. Theoretische Grundlagen

schlußkörpern, z. B. Prä-β-Laktamase (Rinas und Bailey, 1993) oder β-Galaktosidase (unveröffentlichte Ergebnisse). Proteine können z. T. mit guten Ausbeuten im Rahmen der Produktaufarbeitung aus den Einschlußkörpern in ihre aktive Konformation zurückgefaltet werden. Für die Herstellung instabiler oder toxischer Proteine ist die Akkumulation in Einschlußkörpern der einzige Weg. Auch für andere Proteine ist die Aggregation des rekombinanten Proteins gelegentlich erwünscht, weil die Einschlußkörper das Zielprotein schon stark angereichert enthalten und die Reinigung so erleichtert wird (Marston, 1986). Teilweise entfaltete Proteinketten, die hydrophobe Seitenketten exponieren, neigen zur Bildung unlöslicher Aggregate. Diese bestehen aus intakten Proteinketten, die teilweise Sekundärstrukturelemente aufweisen, durch intermolekulare Wechselwirkungen allerdings gehindert wurden, die korrekte (native) dreidimensionale Konformation einzunehmen. Verglichen mit der nativen Konformation weist β-Laktamase in Einschlußkörpern einen verringerten Gehalt an α-Helices und einen erhöhten Gehalt an β-Faltblättern auf. Dieser Trend ist bei höheren Temperaturen noch ausgeprägter (Przybycien et al., 1994). Es ist allgemein anerkannt, daß hohe Temperaturen die Neigung zur Bildung von Einschlußkörpern verstärken (Schein, 1989). Beispielsweise wird die produzierte Gesamtmenge von Interferon-β nicht durch die Temperatur beeinflußt; die Aktivität ist aber bei niedriger Temperatur deutlich größer, da bei hoher Temperatur ein zunehmender Anteil als inaktives Aggregat anfällt (Mizukami et al. zitiert nach Kane und Hartley, 1988). Für einige degradationssensitive Proteine kann eine höhere Temperatur neben der Aggregation auch zur Verringerung der akkumulierten Menge oder zur Zelllyse führen (Chalmers et al., 1990). Der Effekt der Temperatur hängt von fortlaufender Proteinsynthese ab: bei 28°C synthetisierte β-Galaktosidase bleibt aktiv, wenn man die Kultur nach Chloramphenicol24-Zugabe auf 42°C transferiert, einer Temperatur, bei der kaum aktive β-Galaktosidase synthetisiert wird (Lee et al., 1990). Weniger klar ist der Einfluß von Proteineigenschaften auf die Aggregationsneigung. Größe und Bildungsgeschwindigkeit spielen keine Rolle (Schein, 1989). Über die Bedeutung des Prolin-Gehalts25 herrschte lange Unklarheit (Schein, 1989; Wetzel et al., 1991). Kürzlich wurde gefunden, daß das cis/trans-Gleichgewicht und die Isomerisierungsgeschwindigkeit von der N-terminal von Prolin befindlichen Aminosäure bestimmt wird (Reimer et al., 1998).

24

Chloramphenicol ist ein Antibiotikum, das die Proteinsynthese stoppt. Die cis/trans-Isomerisierung der N-terminal von Prolin liegenden Peptidbindung kann der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Proteinfaltung sein. Proteine mit hohem Prolingehalt falten z. T. langsam. 25

2.3. Einschlußkörper als Nebenprodukt der Proteinfaltung

23

Ein Fusionsprotein zeigt nach Insertion einer hydrophoben Sequenz verstärkte Aggregationsneigung bei höherer Temperatur (Lee et al., 1990). Die Hydropathie des gesamten Proteins zeigt jedoch keine Korrelation mit der Aggregationsneigung (Kane und Hartley, 1988); denn nur potentiell exponierte hydrophobe Reste können zur Aggregation führen, während fest im Proteininneren eingebundene hydrophobe Reste keine Rolle spielen. Veränderte Stabilität eines Proteins gegen globale Entfaltung korreliert nicht mit der Neigung zur Bildung von Einschlußkörpern (Chrunyk et al., 1993). Diese Daten beziehen sich aber auf die vollständige Entfaltung, während zur Aggregation ja ein nur partiell denaturiertes Konformer reichen würde (Schein, 1989). Der physiologische Zustand des Wirtes scheint einen erheblichen Einfluß auf die Bildung von Einschlußkörpern zu haben, da sie für manche Proteine erst in der stationären Phase auftritt, in der exponentiellen Phase aber selbst bei hoher Bildungsgeschwindigkeit nicht (Cheng, 1983; Rinas und Bailey, 1993). Für einige rekombinante Proteine zeigt die Aktivität bezogen auf die Biomasse ein Maximum über der Wachstumsrate, während die Bildungsgeschwindigkeit mit bei kleiner Wachstumsrate steigender Plasmidkopienzahl zunimmt (Seo und Bailey, 1986; Fu et al., 1993). Hellmuth et al. (1994) erklären dies mit der bei kleiner Wachstumsrate verringerten Effizienz der Faltung. Informationen über den Mechanismus der Bildung von Einschlußkörpern stammen vor allem aus zwei Quellen: erstens aus in vitro Experimenten, in denen in Konkurrenz zur Rückfaltung denaturierter Proteine Aggregation beobachtet wird, und zweitens aus der Analyse der Aggregation mutierter Proteine in vivo. Bei der Rückfaltung in vitro kollabiert das denaturierte Protein bei der Entfernung des chaotropen Reagenz innerhalb von Millisekunden zu einer kompakten Form, die hydrophobe Aminosäure-Seitenketten im Inneren verbirgt. Dabei bilden sich auch Sekundärstrukturen. Diese wechselwirken miteinander, um ihre Anordnung im Raum zu finden und die native Tertiärstruktur auszubilden. Währenddessen durchläuft das Protein möglicherweise eine Reihe kinetisch definierter teilweise gefalteter Intermediate (Hartl, 1996). Die Aggregation in vitro wird durch die Assoziation mehrerer Peptidketten zu Multimeren bestimmt. Sie beruht mutmaßlich auf einer Konkurrenz zwischen spezifischen Wechselwirkungen26 teilweise gefalteter Intermediate (London et al., 1974; Speed et al., 1996) und intramolekularen Wechselwirkungen, die zur korrekten Faltung führen (Kiefhaber et al., 1991).

26

Zum Teil lassen sich die spezifischen Wechselwirkungen teilweise gefalteter Intermediate angeben, die zur Aggregation führen: für die Phosphoglycerat-Kinase bindet ein hydrophobes β-Faltblatt an die Oberfläche einer α-Helix (zitiert in Mukhopadhyay, 1997).

24

2. Theoretische Grundlagen

Die Aggregation folgt daher einer Kinetik höherer Ordnung (Zettlmeißel et al., 1979). Es kann dabei zum Einschluß nativen Proteins kommen. Dieses copräzipitiert, kann aber durch intensives Schütteln aus den Aggregaten befreit werden (Goldberg et al., 1991). Da die Aggregation von denaturierten Proteinen ausgeht, wurde geschlossen, daß dies auch bei der Bildung von Einschlußkörpern in vivo der Fall sei. Andere führen an, daß die Aggregation in Konkurrenz zur Faltung auftritt; die Einschlußkörper also von neu-synthetisierten Proteinen gebildet würden. Wetzel und Chrunyk (1994) fanden, daß ein in Einschlußkörpern anfallendes Protein in vitro nicht aggregiert, wenn es nach Rückfaltung bei der Kultivierungstemperatur inkubiert wird. Sie folgerten, daß die Einschlußkörper-Bildung in vivo gestörte Faltung anzeige. In vitro war die Konzentration – verglichen mit dem „Molekularen Gedränge“ in vivo, wo 340 g L-1 an Makromolekülen (Hartl, 1996), davon 150 g L-1 an Protein (King et al., 1996) vorliegen – gering. Da die Aggregation in vitro stark von der Proteinkonzentration abhängt, sind Rückschlüsse auf Vorgänge in der Zelle mit Vorsicht zu ziehen. Die Daten schließen nicht aus, daß die Konzentration denaturierter Proteine in vivo die Kapazität der Chaperone, Aggregation zu verhindern (s. 2.4), übersteigt, wodurch die Einschlußkörper entstehen (z. B. Mukhopadhyay, 1997). Das Verständnis der Bildung von Einschlußkörpern wurde weitgehend von den Untersuchungen von King und Mitarbeitern an der Endorhamnosidase (TSP für tailspike protein) des Bakteriophagen P22 bestimmt (King et al., 1996). TSP faltet über ein „Protrimer“ in seine native Konformation27. Bei höherer Temperatur wird das Protrimer nicht mehr gebildet. Statt dessen werden Einschlußkörper gefunden. Das Gleichgewicht zwischen produktivem Monomer I und zu Aggregation neigendem Monomer I* wird durch hohe Temperatur zu I* verschoben. Es ließen sich Mutanten von TSP isolieren, bei denen das Gleichgewicht zu I* verschoben war und die schon bei niedrigen Temperaturen aggregieren. Viele dieser Mutationen sind in oder nahe bei einer β-Wende lokalisiert, weshalb sie keinen Einfluß auf die Stabilität der bei permissiver Temperatur gebildeten nativen Konformation haben. Suppressor-Mutanten unterdrücken die Aggregation, ohne die Faltungsgeschwindigkeit oder Stabilität der nativen Konformation zu verändern. Es ist unbekannt, ob die SuppressorMutanten das produktive Intermediat stabilisieren oder die zur Aggregation führenden Wechselwirkungen28 minimieren. Die Aggregation selbst läuft über die Zusammenlagerung von 27

Die native Konformation des TSP ist ein Trimer, der wegen seiner Resistenz gegen SDS von nicht-nativen Konformationen unterschieden werden kann. Auf nativen Gelen unterscheidet man ferner Monomere von nichtnativen Trimeren („Protrimer“), denen noch einige Wechselwirkungen zwischen den drei Ketten fehlen. 28 Die intermolekulare Wechselwirkung beruht mutmaßlich auf der Ausbildung von gemischten β-Faltblättern aus β-Strängen verschiedener Monomere.

2.4. Einfluß des Wirtes auf die Proteinfaltung

25

Monomeren. Da die Aggregation nach Verbrauch aller Monomere weitergeht, binden die entstehenden Multimere wahrscheinlich auch aneinander. Die Interpretationen sind allerdings nicht allgemein anerkannt. Strittig ist, ob die Bildung von Einschlußkörpern in vivo auch in Konkurrenz zur Faltung auftritt (Goldberg, 1985; Kopetzki et al., 1989; Mitraki et al., 1991), oder ob sie von partiell denaturierten Konformeren ausgeht (Schein, 1989). Aggregation als Nebenprozeß der Faltung findet sich nämlich hauptsächlich bei oligomeren Proteinen (zitiert in Wetzel, 1994). Dieser Punkt ist eng mit der Frage verbunden, wie Chaperone wirken29, und wird in 2.4 wieder aufgegriffen. Weiterhin umstritten ist die Art der Wechselwirkungen, die die Aggregation hervorrufen. Spezifische Wechselwirkung zwischen den aggregierenden Proteinen (Goldberg, 1985; Brems, 1988; Wetzel, 1994; Speed et al., 1996) kann die starke Anreicherung jeweils eines Proteins in den Einschlußkörpern erklären. Unspezifische Wechselwirkungen (Beissinger und Buchner, 1998) können z. B. zwischen exponierten hydrophoben Bereichen der Proteine auftreten (Schein, 1989; Jaenicke, 1995; Murby et al., 1995). Während bei der Renaturierung von Proteinen in vitro die Aggregation meist einer höheren Ordnung folgt (Kiefhaber et al., 1991; Jaenicke, 1995), z. B. n = 2,5 (Clarke und Lund, 1996), weil das Zusammenfinden der Intermediate die Geschwindigkeit der Aggregation bestimmt, werden für die Aggregation in vivo zwei Phasen gefunden. Nach einer ersten, langsamen Phase mit Kinetik höherer Ordnung (z. B. n = 19 für Sichelzellhämoglobin, Jarret und Lansbury, 1992) folgt schnelle Anlagerung weiterer Monomere nach Kinetik erster Ordnung. Dies gilt z. B. für die Ablagerung von β-Amyloid-Plaques bei Morbus Alzheimer (Esler et al., 1996) und in vitro für die thermisch induzierte Aggregation (Knappik und Plückthun, 1995): die Aggregation ist zwar konzentrationsabhängig, folgt aber bei gegebener Konzentration pseudoerster Ordnung. Bei der Produktion von rekombinanten Proteinen (Carrió et al., 1998) finden sich nur wenige Einschlußkörper (meist ein oder zwei pro Zelle). Die Aggregation wird also hauptsächlich durch die zweite Phase bestimmt und folgt einer Kinetik erster Ordnung. 2.4

Einfluß des Wirtes auf die Proteinfaltung

2.4.1 Aufgaben und Funktionsweisen von Chaperonen Im Gegensatz zu „Foldasen“, also Enzymen wie Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen oder Protein-Disulfide-Isomerasen, die geschwindigkeitsbestimmende Schritte der Proteinfaltung beschleunigen, haben Chaperone eine andere Aufgabe (Thomas et al., 1997), wenn es z. T. auch Überschneidungen zwischen beiden Gruppen geben kann (Wang und Tsou, 1998).

29

Unterstützen sie die Faltung neuer Proteinen oder verhindern sie die Aggregation denaturierter Proteine?

26

2. Theoretische Grundlagen

Chaperone können nicht-native Proteine erkennen und binden, wodurch sie Aggregation und damit den irreversiblen Verlust der Proteine verhindern. Ergebnis kann die Faltung in die native Konformation oder Degradation irreversibel geschädigten Proteins sein. Es lassen sich zwei Klassen unterscheiden: ATP-unabhängige Chaperone (genannt sHsp, small heat shock proteins, wegen ihrer Masse zwischen 15 und 40 kDa) dienen als „Proteinpuffer“, die exponierte hydrophobe Bereiche abdecken (Jakob et al., 1993), bis eine ATP-abhängige Komponente die „Weiterverarbeitung“ übernimmt. Zu dieser Gruppe gehört SecB, das Proteine des Periplasmas oder der Äußeren Membran in einer translokationskompetenten Form hält. Die ATP-abhängige Komponente ist das integrale Membranprotein SecA. IbpA und IbpB, die in Einschlußkörpern rekombinanter Proteine gefunden werden (Allen et al., 1992), sind ATPunabhängige Chaperone, die mit DnaKJ kooperieren (Veinger et al., 1998). In Eukaryonten bindet Hsp25 durch Streß denaturierte Proteine, bis unter permissiven Bedingungen Hsp70 die ATP-abhängige Faltung bewerkstelligt. Chaperone, die vorhandene Aggregate auflösen (Parsell et al., 1994; Glover und Lindquist, 1998), könnten sich als dritte Klasse erweisen. ATP-abhängige Chaperone binden Substratproteine in einem niederaffinen Zustand, wodurch die Hydrolyse des gebundenen ATP ausgelöst und eine erhebliche Konformationsänderung zum hochaffinen Zustand eingeleitet wird. Hierbei wird das gebundene unvollständig gefaltete Protein partiell denaturiert. Ein Cofaktor bindet und erleichtert den Austausch von ADP durch ATP, wodurch das Substrat freigesetzt wird (Beissinger und Buchner, 1998). Diesem Mechanismus folgen GroEL-GroES und DnaK-DnaJ-GrpE. Mit ATP bestücktes DnaK (DnaK-ATP) kann Substrate schnell, aber mit niederer Affinität binden, wodurch die Verweilzeit am Chaperon zu kurz für eine Wirkung ist; DnaK-ADP bindet fester, aber zu langsam, als daß Aggregation verhindern werden könnte. DnaJ bindet ein Substrat mit einer geeigneten Geschwindigkeit und Affinität. In Abwesenheit von DnaJ verläuft die Substratbindung von DnaK zweiphasig und ist nicht mit der ATP-Hydrolyse gekoppelt (Schmid et al., 1994). Obwohl also DnaK in der Primärstruktur aufeinanderfolgende hydrophobe Aminosäuren erkennt, wird es wahrscheinlich durch DnaJ zum Substrat gelenkt (Mayer und Bukau, 1998). Die Substratbindung durch DnaJ erfolgt über eine Zink-FingerStruktur, wie man sie von DNA-bindenden Proteinen kennt (Szabo et al., 1996). DnaJ bindet mit der sogenannten J-Domäne an DnaK, transferiert das Substrat auf DnaK und stimuliert die ATP-Hydrolyse, wodurch das Substrat mit hoher Affinität an DnaK gebunden wird. DnaJ verläßt den Komplex wahrscheinlich an dieser Stelle. GrpE verdrängt ADP aus dem Komplex, worauf schnell ATP bindet und das Substrat freigesetzt wird (Mayer und Bukau, 1998).

2.4. Einfluß des Wirtes auf die Proteinfaltung Dies verhindert

die

Akkumulation

eines

27 langlebigen

DnaJ-Substrat-DnaK-ADP-Pi-

Komplexes (Pierpaoli et al., 1998). Die Geschwindigkeit des Zyklus wird durch die ATP-Hydrolyse bestimmt. Der damit verbundene Übergang von nieder- zu hochaffinem Zustand wird als der „Kraftakt“, der die Chaperonwirkung vermittelt, angesehen (Pierpaoli et al., 1997). DnaJ koppelt die ATP-Hydrolyse mit einer Konformationsänderung von DnaK; ohne DnaJ verläuft auch dieser Prozeß zweiphasig (Pierpaoli et al., 1998). Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt benötigt bei 25°C etwa 15 s (GroEL) bzw. 17 s (DnaK) (Beissinger und Buchner, 1998). Unabhängig vom Faltungszustand verlassen die Proteinsubstrate die Chaperon-Komplexe; sie falten dann im Cytosol oder werden erneut durch ein Chaperon gebunden (Beissinger und Buchner, 1998). Manche halten die Freisetzung nicht-nativer Proteine für eine Ausnahme, die „unfaltbare“ Proteine der Degradation zugänglich machen soll (Hartl, 1996). Tatsächlich scheint die Affinität von DnaJ und GrpE zu DnaK bei höheren Temperaturen verringert und die ATP-Hydrolyse verzögert zu werden, so daß thermolabile Proteine stabil gebunden werden (Diamant und Goloubinoff, 1998). Die Fähigkeit von GroEL, Proteine in einer Form, die schneller zur nativen Konformation falten kann als das ursprünglich gebundene Konformer, freizusetzen, ist bei höherer Temperatur gestört und wird erst bei permissiver Temperatur reaktiviert (Fedorov und Baldwin, 1997). Die Rolle von DnaK ist vielfältig: Kontrolle von Aktivität und Abbau regulatorischer Proteine, Translokation durch die Innere Membran, Flagellensynthese, Phagenreplikation, Erhaltung der negativen DNA-Superwindungen und Signalübertragung. Daher geht der Mangel an DnaK mit pleiotropen Effekten einher, weil alle instabilen Proteine betroffen sind und deren Funktionen ausfallen. Defekte treten z. B. bei der Chromosomen-Segregation und der Aufteilung von in kleiner Anzahl pro Zelle vorhandener Plasmide (Bukau und Walker, 1989) oder bei der DNA-Replikation (Foster und Marinus, 1992; Wyman et al., 1993) auf. Daneben ist eine spezielle Funktion zum Schutz der Membranen denkbar. DnaK ist in E. coli mit der Inneren Membran assoziiert und kann durch osmotischen Schock freigesetzt werden (el Yaagoubi et al., 1994). In anderen Organismen gibt es mehrere DnaK-Varianten, von denen eine ganz an der Membran sitzt (Nimura et al., 1996). Es gibt in E. coli ein DnaJ-ähnliches Protein (DjlA), das in die Membran inseriert ist und auf der cytoplasmatischen Seite die J-Domäne (die in DnaJ für die Wechselwirkung mit DnaK zuständig ist) exponiert (Clarke et al., 1996). Auch kleine Hitzeschockproteine (sHsp) sind mit der Membran assoziiert (Jobin et al., 1997).

28

2. Theoretische Grundlagen

Eine Rolle von GroEL als „Lipochaperonin“, das bei hoher Temperatur die Membran stabilisiert, wird diskutiert (Török et al., 1997). DnaK bindet nicht-native Proteine mit breitem Substratspektrum, um Aggregation zu verhindern und Rückfaltung zu erlauben, native Proteine dagegen nur, wenn sie spezifische Bindungsstellen aufweisen wie z. B. die C-Region von σ32. Die Aufrechterhaltung der „Haushaltsfunktionen“ der Hsp70-Systeme soll auch unter Streßbedingungen durch Redundanz erreicht werden: Es gibt Homologe zu DnaK und DnaJ, in E. coli z. B. das nichtstreßinduzierbare System HscA/HscB (Mayer und Bukau, 1998). Daneben existieren zwei Homologe zu DnaJ, die mit DnaK zusammenarbeiten. Das membrangebundene Homolog DjlA ist für die Signaltransduktion zuständig; es reguliert die Kapsel-Polysaccharid-Synthese. In Saccharomyces cerevisiae existieren sogar 14 parallele Systeme, die einander nur teilweise komplementieren können (Mayer und Bukau, 1998). Thema ausführlicher Debatten ist die Frage, ob zu den Haushaltsfunktionen der Chaperone auch die Faltung neu-synthetisierter Proteine gehört, oder ob die wesentliche Funktion die Verarbeitung denaturierter Proteine ist. Einige Argumente werden im folgenden zusammengefaßt. Bei der Rückfaltung in vitro kollabieren denaturierte Proteine in Millisekunden in eine kompakte Form. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist die Ausbildung der hochgeordneten nativen Tertiärstruktur. Im Gegensatz dazu erfolgt die Biosynthese vektoriell. Zur Faltung muß mindestens eine vollständige Domäne (etwa 100 bis 200 Aminosäuren) vorhanden sein. Die zur Aggregation neigende nascente Kette muß bis dahin in einer faltungskompetenten Form gehalten werden. Dies wird in Eukaryonten durch die Assoziation von Hsp70/Hsp40 (DnaK/DnaJ-Homologen) erreicht. Proteine mit einer Domäne können nach der Fertigstellung posttranslational falten, Mehr-Domänen-Proteine falten wahrscheinlich cotranslational (Hartl, 1996). Bei der Rückfaltung denaturierter Proteine im eukaryontischen Cytosol (Reticulocyten-Lysat) bindet das Protein zunächst an Hsc70 (DnaK-Homolog), später an TRiC (GroEL-Analog); der Transfer ist ATP-abhängig. Dabei kann das Protein durch mutiertes GroEL (trap) abgefangen werden. Neu-synthetisierte Proteine im in vitro Translationsversuch werden von TRiC gebunden und nur vollständig gefaltet freigesetzt; GroEL (trap) kann diese Proteine nicht abfangen. Es wird geschlossen, daß sich Faltung neu-synthetisierter Proteine und die Rückfaltung denaturierter Proteine (die in vivo unter Streßbedingungen entstehen) mechanistisch unterscheiden, weil im letzteren Fall unvollständig gefaltete Konformere von den Chaperonen freigesetzt werden (Frydman und Hartl, 1996). Für Säugerzellen und Hefe wurde gezeigt, daß die Faltung neu-synthetisierter Proteine vollständig innerhalb von TRiC erfolgt. Dagegen wird für

2.4. Einfluß des Wirtes auf die Proteinfaltung

29

bakterielles GroEL gefunden, daß es ausschließlich posttranslational mit Proteinen wirkt und sie dabei partiell denaturiert (Reid und Flynn, 1996). Etwa 5 – 15% der neu-synthetisierten Proteine könnten mit GroEL wechselwirken (Lorimer, 1996). Das Protein wird in einer Form freigesetzt, die die Bindung an Chaperone (auch wieder an DnaKJ) erlaubt (Buchberger et al., 1996). Während also in Eukaryonten die Faltung neu-synthetisierter Proteine innerhalb eines GroEL-Analogs erfolgt, ist GroEL für bakterielle Proteine nicht obligatorisch. Offen bleibt die Frage, ob die Wechselwirkung mit Hsp70 erforderlich für neu-synthetisierte Proteine ist. E. coli mit Mutationen in rpoH, dem Gen des Hitzeschock-Sigmafaktors σ32, können keine Chaperone bilden. Bei permissiver Temperatur markierte Proteine werden in den Mutanten korrekt gefaltet, während es bei höherer Temperatur zu intensiver Aggregation kommt. Die Expression von groELS und dnaKJ + grpE zu physiologischen ChaperonKonzentrationen konnte die rpoH-Mutation komplementieren; die Beobachtungen beruhten also nicht auf sonstigen Effekten der rpoH-Mutation (Gragerov et al., 1992). Die Aggregation hängt von fortlaufender Proteinsynthese ab; Zugabe von Chloramphenicol unterdrückt die Aggregation. Daraus schloß man, daß Chaperone für die Faltung neu-synthetisierter Proteine erforderlich ist (Gragerov et al., 1992). Mutationen in dnaK allein lösen die Aggregation nicht aus, zusammen mit groEL- oder groES- tritt aber Aggregation auf (Gragerov et al., 1992). Hesterkamp und Bukau (1998) dagegen zeigen, daß die Konzentration an DnaK und HscA (ein weiteres Hsp70-Protein in E. coli) zu gering sind, um die hydrophoben Reste eines Großteils nascenter Peptidketten abdecken zu können. E. coli mit Mutationen in dnaK sind bei 30°C lebensfähig wie der Wildtyp. Insbesondere sind neu-synthetisierte Proteine bei 30°C und bei 42°C in Wildtyp und dnaK-Mutante gleichermaßen löslich (Hesterkamp und Bukau, 1998). Wenn auch DnaK die Faltung neu-synthetisierter Proteine effizienter gestalten mag, ist es in E. coli nicht strikt notwendig. Möglicherweise ermöglicht die 14fach schneller Proteinsynthese in E. coli (verglichen mit Säugerzellen), auf DnaK zu verzichten, während Hsp70 in Säugerzellen erforderlich zu sein scheint. Dagegen aggregieren in dnaK-Mutanten existierende Proteine nach einem Temperatursprung extensiv (Hesterkamp und Bukau, 1998). Die thermolabile Luciferase wird inaktiv gebildet und durch DnaK in die aktive Form überführt. Dieser Prozeß findet in dnaK-Mutanten nicht statt (Leontyeva und Ugarova, 1996). Das bei 30°C gebildete Enzym verliert nach einem Temperatursprung auf 42°C seine Aktivität; diese wird in Wildtyp-E. coli nach einer Inkubation bei 30°C ohne Proteinsynthese regeneriert. In dnaK-Mutanten dagegen aggregiert die Luciferase bei einem Temperatursprung auf 42°C und kann auch bei 30°C nicht reaktiviert werden (Hesterkamp und Bukau, 1998).

30

2. Theoretische Grundlagen

Während also DnaK für die Faltung neu-synthetisierter Proteine in E. coli entbehrlich ist, spielt es eine wichtige Rolle bei der Verhinderung der Aggregation Hitze-denaturierter Proteine (Hesterkamp und Bukau, 1998). Zur Erklärung der Chaperonwirkung reicht es aus, daß ATP-abhängige Chaperone unter Streßbedingungen denaturierte, zur Aggregation neigende Proteine in einem Wechsel zwischen hoch- und niederaffinem Zustand binden und teilweise entfaltet zu einem erneuten Faltungsversuch wieder entlassen können (Beissinger und Buchner, 1998). Für andere Chaperone, die zu exportierende Proteine in einer translokationskompetenten Form halten, wie SecB oder z. T. auch DnaK, ist dagegen klar, daß sie in erster Linie mit neu-synthetisierten und nicht mit denaturierten Proteinen wechselwirken. 2.4.2 Chaperone und rekombinante Proteine Wenn auch homologe Proteine in E. coli nicht auf DnaKJ bei der Faltung nach ihrer Synthese angewiesen sind, ist die Akkumulation löslicher heterologer oder überexprimierter Proteine in Mutanten mit verringerter Chaperonaktivität gestört. In dnaK- oder rpoH-Mutanten aggregieren z. B. Rubisco30 aus verschiedenen bakteriellen Quellen (Checa und Viale, 1997) oder βGalaktosidase (Thomas und Baneyx, 1996a). Coexpression von Chaperonen kann die Aggregation verringern, wie zuerst für die Coexpression von groELS mit Rubisco gezeigt wurde (Goloubinoff et al., 1989), beeinflußt aber auch die Proteolyse: wenn die Erreichbarkeit des Substrates für Proteasen erhöht wird oder wenn degradationssensitive Konformere effizienter gefaltet werden, wird der Abbau beschleunigt bzw. verhindert (Thomas et al., 1997). Die Wirkung wird von der Konzentration der Chaperone bestimmt: ein im Wildtyp instabiles Protein akkumuliert bei Überexpression von dnaK in löslicher Form, wogegen es in dnaKMutanten aggregiert (Nishihara et al., 1998). Das gleiche Protein ist bei Expression von dnaK zu physiologischen Konzentrationen in rpoH-Mutanten löslich, bei Überexpression wird es allerdings abgebaut (Nishihara et al., 1998). Der genetische Hintergrund spielt also eine Rolle, weil dieses Protein bei höherer Temperatur auch auf ein zweites Chaperon-System, hier GroELS, angewiesen ist. Auch β-Galaktosidase ist auf weitere (nicht identifizierte) ChaperonSysteme angewiesen: in rpoH-Mutanten stellt die Überexpression von dnaKJ nur einen Teil der Löslichkeit wieder her, während GroELS keinen Einfluß hat (Thomas und Baneyx, 1996a). Die Spezifität für bestimmte Chaperon-Systeme zeigt sich auch daran, daß die Überexpression von dnaKJ, nicht aber die von groELS die Löslichkeit bestimmter Proteine verbessert (Blum et al., 1992; Thomas und Baneyx, 1996b; Checa und Viale, 1997).

30

Rubisco…Ribulose-Bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase ist ein Enzym, das in photolithoautotrophen Organismen die Kohlendioxid-Fixierung katalysiert. Sie kommt als Dimer oder Hexadekamer vor; die zitierten Ergebnisse sind für beide Formen gefunden worden.

2.4. Einfluß des Wirtes auf die Proteinfaltung

31

Die Coexpression von Chaperonen kann die Degradation fördern (Sherman und Goldberg, 1996). Mit Überexpression von groELS wurde der Abbau eines rekombinanten Proteins um den Faktor 2-3 beschleunigt (Kandror et al., 1994). In anderen Fällen wurde durch ChaperonCoexpression die Halbwertszeit eines rekombinanten Proteins um den Faktor 10 verlängert (Olins und Lee, 1992). Die Überexpression von groELS verhindert die Degradation eines Membran-lokalisierten Transporters zum Teil (Sato et al., 1994). In rpoH-Mutanten wird die Hitzeschockantwort vermieden; es wird mehr Produkt gewonnen (Surek et al., 1991). Letzteres kann allerdings auch ein Effekt der Unterdrückung von Hitzeschock-Proteasen sein. Auch in dnaK-Mutanten kommt es nicht zum Abbau eines mutierten Proteins, das im Wildtyp stabile Komplexe mit DnaK bildet (Sherman und Goldberg, 1992). In manchen Fällen wird die Degradation verzögert (Visick und Clarke, 1995), weil die Proteine in Einschlußkörpern anfallen, wo sie der Proteolyse nicht zugänglich sind. Oben war wiedergegeben worden, wie die Stabilität eines Proteins von der DnaK-Konzentration abhängt (Nishihara et al., 1998). Einige abnormale Proteine werden in lon dnaK-Doppelmutanten langsamer abgebaut als in lon dnaK+ Hintergrund, der thermolabile LacI-Repressor dagegen schneller (Keller und Simon, 1988). Es spielen also auch Protein-spezifische Eigenschaften eine Rolle. Daneben kann die Chaperon-Coexpression weitere Folgen haben: Die Größe der Einschlußkörper kann verringert werden; unter Umständen erhöht sich ihre Anzahl (Blum et al., 1992). Wenn Proteine mit einer Signalsequenz mit hoher Affinität an die Chaperone binden, kann ihr Export verzögert werden (Olins und Lee, 1992). Chaperone haben also einen Einfluß auf das Schicksal von heterologen oder überexprimierten Proteinen, der besonders bei erhöhten Temperaturen merklich wird. Proteine können in die native Konformation falten, zu Einschlußkörpern aggregieren oder abgebaut werden. Welche(s) Chaperon-System(e) entscheidend ist bzw. sind, hängt vom jeweiligen Protein, dem genetischen Hintergrund, der Konzentration der Chaperone und der Temperatur ab. Chaperone unterstützen die Faltung neu-synthetisierte Proteine in Eukaryonten, bei denen die Proteinsynthese langsam verläuft und nascente Ketten vor intermolekularen Wechselwirkungen geschützt werden müssen. In Prokaryoten wird die Wechselwirkung mit neusynthetisierten Proteinen nur bei Protein-Mutanten, die besonders langsam falten, beobachtet. Unter Streßbedingungen verhindern Chaperone die Aggregation denaturierter bestehender Proteine. Besonders bei fortlaufender Proteinsynthese, welche die Menge potentiell denaturierten Proteins erhöht, oder in Mutanten mit verringerter Chaperonaktivität kann die Menge denaturierten Proteins die Kapazität der Chaperon-Systeme überschreiten, wodurch es zu Aggregation kommen kann.

32

3. Material und Methoden

3 Material und Methoden 3.1 Stamm und Plasmide Zur Produktion des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors kam das Bakterium Escherichia coli TG1 (DSM 6056) (Sambrook et al., 1989), ein Abkömmling des Sicherheitstammes K12, zum Einsatz. Er ist Thiamin-bedürftig und wächst auf Minimalmedium. Das lac-Operon ist aus dem Genom deletiert; das Regulatorgen lacIq ist auf einem F’-Episom vorhanden. Zur Erhaltung des F’-Plasmids wird ein Selektionsdruck durch die Deletion der Gene der zur Prolin-Biosynthese nötigen Enzyme aufrechterhalten, die durch intakte proAB auf dem Episom komplementiert werden. Insgesamt ist der Genotyp supE hsd∆5 thi ∆(lac-proAB) F’[traD36 proAB+ lacIq lacZ∆M15].

Abb. 5: Karte des in den Kontrollkultivierungen verwendeten Plasmides pCytexP1 und des in den Kultivierungen zur bFGF-Produktion eingesetzten Plasmides pλFGFB Gezeigt ist das Promotortandem λPRPL31, die Translationsstartstelle TIR des Gens atpE, die Insertionsstelle des bFGF-Gens, der Terminator des Phagen fd, der Replikationsstartpunkt ori, das Gen bla, das für die β-Laktamase, die Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin verleiht, kodiert, ein f1-ori (zur Herstellung von EinzelstrangDNA) und das Gen des thermolabilen Repressors cI857 und die Restriktionsschnittstellen der Poly-Cloning-Site. Auf dem Plasmid pλFGFB (Seeger et al., 1995) steht das bFGF-Gen unter der Kontrolle des Promotortandems λPRPL31. Dieser wird durch den Repressor cI reprimiert, welcher auf dem Plasmid als temperatursensitive Mutante cI857 codiert wird (Abb. 5). Bei höheren Temperatu-

31

Hintereinander geschaltete Promotoren pR und pL des Bakteriophagen λ

3.2. Medien und Vorkulturen

33

ren32 wird cI inaktiviert, wodurch die bFGF-Produktion freigegeben wird. Das Plasmid ist von pCytexP1 abgeleitet, das zwischen Promoter und Terminator nur eine Poly-Cloning-Site33, von der ein kurzes Stück (etwa 250 nt) nicht translatierbarer mRNA (sie kodiert für nur 10 Aminosäuren) abgelesen wird, trägt. Das Plasmid pCytexP1 wurde als Kontrolle verwendet. Alle Plasmide tragen als Selektionsmarker das Gen einer β-Laktamase, die Resistenz gegen Ampicillin verleiht. 3.2 Medien und Vorkulturen Für die Stammhaltung und erste Vorkultur wurde das komplexe Luria-Bertani-Medium (LB) verwendet (Tabelle 1), für weitere Vorkulturen und in der Hochzelldichtekultivierung ein synthetisches Minimalmedium (HDF). In der Zufütterungsphase wurde eine konzentrierte HDF-Variante („Feed“) (Tabelle 2) eingesetzt. Tabelle 1: Verfahren zur Stammhaltung und Vorkultur; LB-Medium LB-Medium: 10 g Bactotrypton (Difco) 5 g Hefeextrakt (Difco) 5 g Natriumchlorid ad 1000 mL Wasser Amp-Lösung: 50 mg mL-1 Ampicillin Thi-Lösung: 4,5 mg mL-1 Thiamin Stammhaltung: • LB-Vorkultur mit einem Volumen sterilen 87%igen Glyzerins vermischen • Bei -70°C in Cryovials (Nalgene) aufbewahren Erste Vorkultur: • Agarplatte (LB-Medium + 15 g L-1 Agar agar) mit 200 µL Amp-Lösung versetzen, aus der Stammhaltung animpfen, über Nacht bei 37°C inkubieren • 10 mL LB-Flüssigmedium + 10 µL Amp-Lösung von der Platte animpfen, 12 Stunden bei 30°C auf dem Schüttler (100 rpm) inkubieren Zweite Vorkultur: • 50 mL HDF-Medium + 50 µL Thi-Lösung + 50 µL Amp-Lösung + 100 µL erste Vorkultur 14 h bis 20 h (abhängig vom Plasmid) bei 30°C inkubieren

32

Die Schmelztemperatur, bei der 50% der Repressormoleküle inaktiviert sind, beträgt 42°C (Okita et al., 1989). Ansammlung von Restriktionsschnittstellen, die im Plasmid nur je einmal vorkommen und zur Insertion des zu exprimierenden Gens verwendet werden können. 33

34

3. Material und Methoden

Tabelle 2: Zusammensetzung der synthetischen Medien Stoff Glukosemonohydrat a MgSO4 * 7H2O a Fe(III)Citrat c CoCl2 * 6H2O c MnCl2 * 4H2O c CuCl2 * 2H2O c H3BO3 c Na2MoO4 * 2H2O c Zn(CH3COO)2 * 2H2O c EDTA c KH2PO4 d (NH4)2HPO4 d Zitronensäure*H2O d Ucolub N115 Thiamin b Ampicillin b

HDF e 30 g L-1 1,2 g L-1 100,8 mg L-1 2,5 mg L-1 15 mg L-1 1,5 mg L-1 3 mg L-1 2,1 mg L-1 33,8 mg L-1 14,1 mg L-1 13,3 g L-1 4 g L-1 1,7 g L-1 0,1 mL L-1 4,5 mg L-1 50 mg L-1

Feed f 875 20 40 4,0 23,5 2,3 4,7 4,0 16 13

g L-1 g L-1 mg L-1 mg L-1 mg L-1 mg L-1 mg L-1 mg L-1 mg L-1 mg L-1

a

einzeln autoklavieren sterilfiltriert nach dem Abkühlen zugeben c als Stammlösung zugeben d vor dem Autoklavieren pH-Wert auf 6,3 einstellen e nach dem Autoklavieren pH-Wert auf 6,8 einstellen f pH-Wert ist etwa 4 b

3.3 Reaktor und Prozeßführung Der Reaktor Biostat U50K (B. Braun International, Melsungen) ist ein Edelstahlgefäß mit einem Arbeitsvolumen von 50 Litern. Regelung der Prozeßgrößen (Temperatur, pH, pO2) und insbesondere der Zufütterung sowie die Meßdatenerfassung erfolgte mit dem Prozeßleitsystem µXL (Yokogawa, Japan). Für die Abgasanalyse wurden die Meßsysteme Oxygor und Unor 6N (Maihak, Hamburg) benutzt. Der Reaktor und die Vorlagen für Substrat, Lauge und Entschäumer wurden gewogen (Waagen von Satorius, Göttingen). Zusätzlich wurden Kulturfluoreszenz (Anregungswellenlänge 360 nm, Meßwellenlänge 450 nm) und Trübung (Sonden von Ingold, Urdorf, Schweiz) gemessen. Leitfähigkeitssonden überwachten die Schaumbildung und kontrollierten die Zugabe von Entschäumer Ucolub N115. Die Temperatur war durch einen Kühlmantel schnell und genau zu regeln. Die Probenahme erfolgte über ein dampfsterilisierbares Dreiwegeventil. Der erforderliche Massenstrom F(t) im Fed-Batch wurde nach der von Korz et al. (1995) angegebenen Gleichung 2 berechnet. Sie soll der zum Zeitpunkt des Zufütterungsstarts vorlie-

3.4. Protein-Analytik

35

genden Biomasse (X.V)f exponentielles Wachstum mit der eingestellten Wachstumsrate µ set ermöglichen. F (t ) =

1 SF

 µ set   + mS′  ⋅ ( X ⋅ V )f ⋅ exp (µ set ⋅ (t − t f )) ′  YX/S 

(2)

Die Symbole und typische Werte sind in Tabelle 3 angegeben. Der Index f kennzeichnet Werte zum Zeitpunkt des Zufütterungsstarts. Die vorgesehene Wachstumsrate µ set ist deutlich kleiner als die maximale Rate µ max, um den „bakteriellen Crabtree-Effekt“ zu vermeiden. Die eingestellte Wachstumsrate war vor der Induktion µ set = 0,12 h-1, nach der Induktion µ set = 0,08 h-1. Kultivierungen nach diesem Muster mit TG1 pλFGFB werden als „Standardkultivierung“, mit TG1 pCytexP1 als „Kontrollkultivierung“ bezeichnet. Tabelle 3: Symbole in Formel 2: Dimension, Bezeichnung und typische Werte zum Zeitpunkt des Zufütterungsstarts mS′

SF

µ set

Glukosekonzentration

spezifische ErhaltungsWachstumsrate energiebedarf

Glukose pro Zufütterungslösung 0,61 g g-1

Biomasse pro Biomasse und Zeit 0,12 h-1

3.4

Y X′

S

Ausbeutekoeffizient

Glukose pro Biomasse pro Biomasse und Glukose Zeit 0,025 g g-1 h-1 0,5 g g-1

X

V

Zelldichte

Kultur- Zeit volumen

Biomasse pro Volumen 15 g L-1 25 L

t

12 h

Protein-Analytik

3.4.1 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Probenvorbereitung und Gelherstellung Die SDS-Gradienten-Gele (9 – 16% Polyacrylamid) wurden aus einer „schweren” und einer „leichten” Lösung gegossen (s. Tabelle 4). Während des Polymerisierens wurden sie mit Butanol überschichtet, um eine glatte Oberfläche sicherzustellen. Sie wurden anschließend mit Wasser überschichtet und bis zum Gebrauch bei 4°C gelagert. Zum Probenauftrag wird ein Sammelgel (s. Tabelle 4) mit Probentaschen gegossen. Die Proben (bei -70°C gelagerte Zellpellets) wurden wie in Tabelle 5 beschrieben aufgearbeitet. Proben aus dem zellfreien Kulturüberstand wurde abweichend direkt mit einem Volumen SolG bei 95°C denaturiert; davon wurden 100 µ L aufgetragen. Die Trennung erfolgt mit einer Biorad Electrophoresis Power Supply Modell 3000Xi in einer Biorad Protean II Multi-Cell Kammer mit einem Strom von 42 mA pro Gel.

36

3. Material und Methoden

Tabelle 4: Lösungen für die Gradientengele (9 – 16% Polyacrylamid): Die ersten drei Flüssigkeiten werden gemischt, filtriert und entgast; die restlichen Substanzen werden beim Starten der Polymerisation zugegeben (Angaben pro Gel). schwere Lösung

leichte Lösung

Sammelgel

14,08 mL

8 mL

1 mL

1 M Tris[hydroxymethyl]aminomethan (Tris/HCl)

7,21 mL pH 8,8

7,21 mL pH 8,8

1,2 mL pH 6,8

Aqua dest.

5,78 mL

11,88 mL

7,5 mL

83 µL

83 µL

30% (w/v) Acrylamid/ 0,8% (w/v) Piperazindiacrylamid

98% 1,4-Dimethylpiperazin Tetramethylethylendiamin (TEMED) 20% (w/v) Natriumlaurylsulfat (SDS) 5% (w/v) Natriumthiosulfat 10% (w/v) Ammoniumpersulfat (APS)

136,7 µL 62,6 µL 83,3 µL

136,7 µL 62,6 µL 83,3 µL

10 µL 60 µL 30 µL

Tabelle 5: Probenvorbereitung für die Gelelektrophorese Resuspendieren: Biomassepellet auf 1 mL mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7) auffüllen Verdünnen: 600 µL auf OD 4,5 (ausgehend von der während der Kultivierung gemessenen OD) Aufschließen: 2 min Ultraschall (20 kHz, 50% der Maximalleistung, LabSonic 2000U, B. Braun Biotech International, Melsungen) Zentrifugieren: Aliquots von 200 µL 45 min lang bei 38000xg und 4°C; Pellet mit 200 µL Phosphatpuffer waschen, erneut zentrifugieren und das Pellet in 50 µL Puffer aufnehmen Denaturieren: Probe (Gesamtprotein, Überstand oder Pellet) mit einem Volumen SolG 10 min bei 95°C inkubieren Auftragen: Je Probe werden 30 µL aufgetragen. SolG: 7% (w/v) 35% (w/v) 150 mM 250 mM

Natriumlaurylsulfat (SDS) Glyzerin Dithiotreitol (DTT) Tris/HCl, pH 6,8

Coomassie-Färbung Die Gradientengele wurden nach dem Elektrophoreselauf eine Stunde in Fixierlösung (s. Tabelle 6) geschüttelt, dann 20 min in siedend heißer Coomassie-Lösung (0,29 g Coomassie brilliant blue in 250 mL Entfärbelösung, filtriert) gefärbt und in Entfärbelösung entwickelt, bis der Hintergrund wieder transparent war und sich die Proteinbanden deutlich abhoben. Dazu wurde die Entfärbelösung gelegentlich gewechselt.

3.4. Protein-Analytik

37

Tabelle 6: Zusammensetzung der zum Färben benötigten Lösungen Fixierlösung: 400 mL Ethanol 100 mL Essigsäure 500 mL Aqua deion.

Entfärbelösung: 250 mL Ethanol 80 mL Essigsäure 670 mL Aqua deion.

Quantitative Auswertung der eindimensionalen Gele Die quantitative Auswertung der eindimensionalen Gele erfolgt mit einem Scanner elscript 400 (Hirschmann) und dem Auswerteprogramm Scan 400 V1.4, das die Absorption bei 546 nm über der Gellänge aufnahm und die Peaks automatisch integrierte, oder nach Scannen mit dem Tischscanner ScanJet 4C/T von Hewlett-Packard mit der QuantiScan-Software (Biosoft, Cambridge, UK). Die Umrechnung der Peakflächen in Proteinkonzentrationen erfolgte über den Anteil der Fläche an der Summe aller Peakflächen einer Probe (%P-Wert). Mit der Annahme eines konstanten Proteingehalts der Biomasse von E. coli von 550 mg g-1 (Ingraham et al., 1983) kann der %P-Wert des Gesamtproteins direkt in spezifische Proteinkonzentrationen umgerechnet werden. Für die lösliche bzw. unlösliche Fraktion muß mit dem Anteil des löslichen bzw. unlöslichen am gesamten Protein, fL bzw. fA, multipliziert werden. Aus der Massenbilanz fL + fA = 1 und für das bFGF fL* %PL + fA* %PA = %PG ergibt sich fL =

% PG − % PA % PL − % PA

(3)

Für fL wurden Werte zwischen 0,75 und 0,8 erhalten34. 3.4.2 Zweidimensionale Gelelektrophorese Prinzip Die komplexe Proteinmischung, die selbst in einfachen Organismen wie Bakterien vorliegt, läßt sich durch eine einfache Trennung wie die SDS-PAGE nicht vollständig auflösen. Um einzelne Proteine zu erkennen, wurde hier ein weiterer Schritt vorgeschaltet: zunächst wurde das Proteom (Wilkins et al., 1996) nach dem isoelektrischen Punkt (pI), also dem pH-Wert, an dem sich die Ladungen der sauren und basischen Aminosäureseitenketten eines Proteins gerade ausgleichen, getrennt. Dies geschah in einem zylinderförmigen Gel einer Länge von

34

Das Verhältnis der Summe der Peakflächen von löslichem zu der von gesamtem Protein einer Probe ist 0,9. Mit fL = 0,9 kommt es zu Fehlbeträgen in der bFGF-Bilanz. Für Modellierungszwecke wurde daher mit dem aus der Bilanz bestimmten fL-Wert gearbeitet. Dadurch wurde der Anteil löslichen bFGF etwas zu klein eingeschätzt, und die Konzentration unlöslichen bFGFs ging als unabhängige Information verloren

38

3. Material und Methoden

155 mm und eines Durchmessers von ca. 1,5 mm. Anschließend erfolgte auf einem Gradientengel die Trennung nach dem Molekulargewicht wie beschrieben. Gießen der Zylinder-Gele Für eine gute Trennung ist es wichtig, daß die Gele gleichmäßig polymerisieren. Eine besondere Bedeutung kommt der Oberflächen der Röhrchen, in denen die Gele gegossen werden und die gründlich gereinigt werden müssen, zu. Die Reinigung ist in Tabelle 7 beschrieben. Tabelle 7: Schritte zur Reinigung der Röhrchen 1. Gründlich mit Wasser spülen 2. Vier Stunden bei 37°C in 2% Hellmanex-Lösung (Hellma, Müllheim) inkubieren 3. Gründlich mit Wasser spülen 4. Dreißig Minuten bei 80°C in 0,1 M Salzsäure inkubieren 5. Gut mit Milli-Q spülen und mit Druckluft trocknen

Tabelle 8: Lösungen zur Herstellung von 14 Zylinder-Gelen für IEFa) bzw. NEpHGEb) a) IEF…Isoelektrische Fokussierung b) NEpHE…Nicht-Gleichgewichts-pH-Elektrophorese ZG-A c): 5g 1250 µL 3,75 mL

Harnstoff ultrapure 30 % (w/v) Acrylamid/ 0,8% (w/v) Piperazindiacrylamid Wasser

ZG-B: 200 µL Ampholine 3-10 (Serva) 200 µL Ampholine 3-10 (Biorad) a) bei IEF zusätzlich 100 µL Ampholine 5-7 (Biorad) ZG-C: 150 mg 50 µL 450 µL

CHAPS 10% Nonident (NP 40) Milli-Q

c)

Der Harnstoff löst sich sehr langsam; es darf aber keinesfalls zur Beschleunigung des Lösevorgangs erhitzt werden, da der Harnstoff sich sonst zersetzt. Zur Herstellung der Zylinder-Gele wurde die Lösung ZG-A (s. Tabelle 8) vorbereitet. Die Mischung ZG-B wurde zugegeben, dann 500 µL von Lösung ZG-C. Nach der Filtration (mit einem Sterilfilter Ø 0,2 µm) und Entgasung (15 min unter Vakuum) wurde die Polymerisation durch Zugabe von 10 µL TEMED und 20 µL 10% (w/v) Ammoniumpersulfatlösung gestartet. Je 600 µL des Gemisches wurden in ein Reagenzglas gefüllt und 155 mm hoch in die Röhr-

3.4. Protein-Analytik

39

chen gesogen. Nach drei Stunden Polymerisation wurde das Röhrchen mit einem Wassertropfen verschlossen, um ein Feuchtigkeitsreservoir zu erhalten. Das Röhrchen wurde an beiden Enden mit Parafilm abgedichtet und drei weitere Tage polymerisiert. Trennung nach dem isoelektrischen Punkt Die bei -70°C gelagerten Biomasse-Pellets wurden mit 50 mM Phosphatpuffer pH 6,8 auf eine OD von 100 (bzw. 50) verdünnt und durch sechs- bis achtminütige Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Tabelle 9: Zusammensetzung der Probenpuffer für Zylinder-Gele Lysispuffer: 5,7 g 2 mL 1,11 g 250 µL 250 µL 2,4 mL

Harnstoff 10% Nonident (NP-40) Dithiotreitol (DTT) Ampholine 3-10 (Serva) Ampholine 3-10 (Biorad) Wasser

Überschichter: 5,5 g Harnstoff 125 µL Ampholine 3-10 (Serva) 125 µL Ampholine 3-10 (Biorad) 5 mL Wasser Transferpuffer: 1,5 mL 20% Natriumlaurylsulfat (SDS) in Wasser 750 µL 1 M Tris/HCl in Wasser, pH 6,8 100 µL 0,5% (w/v) Bromphenolblau in Wasser 7,7 mL Wasser

Zehn Mikroliter (bzw. 20 µL) Probe wurden mit 10 mg (bzw. 20 mg) Harnstoff und 20 µL (bzw. 40 µL) Lysispuffer (s. Tabelle 9) versetzt; von dieser Mischung wurden 30 µL (bzw. 60 µL) auf ein Zylinder-Gel aufgetragen. Es wurde mit 10 µL Überschichter (s. Tabelle 9) abgeschlossen, und das Röhrchen wurde mit Puffer für die obere Elektrode (s. Tabelle 10) gefüllt. Die Trennung erfolgte in die Trennkammer (Tube Cell Model 175 von Biorad, München) nach den in Tabelle 10 angegebenen Spannungsprofilen. Nach dem Lauf wurden die Zylinder-Gele mit 120 µL Transferpuffer (s. Tabelle 9) versetzt und auf ein Gradientengel (ein SDS-Gradientengel mit 9 - 16% Polyacrylamid) übertragen. Elektrophoreselauf und Coomassie-Färbung wurden wie für eindimensionale Gele beschrieben durchgeführt.

40

3. Material und Methoden Tabelle 10: Bedingungen für IEF und NEpHE Anodenelektrolyt: 6 mM Phosphorsäure (Anode unten bei IEF, oben bei NEpHE) Kathodenelektrolyt: 12,5 mM Natriumhydroxidlösung (Kathode oben bei IEF, unten bei NEpHE) Spannungsprofil: für IEF: 4h 200 V 4h 500 V 8h 2000 V

für NEpHE: 6h 500 V

Quantitative Auswertung der zweidimensionalen Gele Die Gele wurden mit einem Tischscanner ScanJet4 SC/T (Hewlett-Packard) als tiff-file eingelesen. Kontrast und Helligkeit wurden dabei entsprechend der Färbeintensität eines Gels eingestellt, um die Spots möglichst gut hervorzuheben. Die tiff-files wurden mit dem Programm „2-D Analyzer“ (Bio Image, Ann Harbor, Michigan, USA) auf einer Sparc-Station 5 (Sun microsystems) weiterverarbeitet. Die Integrierte Intensität jeden Spots wurde auf die Summe der Integrierten Intensitäten ausgewählter Spots desselben Gels bezogen. Diese etwa 90 Spots waren wegen ihrer Größe oder zeitlich veränderlichen Intensität wichtig. Sie umfaßten konstant 90% der Integrierten Intensitäten aller detektierbaren Spots. Jedem Protein wurde so sein Anteil an der Gesamtmenge (Coomassie-Färbung) bzw. Gesamtproduktion (Autoradiogramm von Gelen radioaktivmarkierter Proben) aller Proteine zugeordnet35. Der Proteingehalt pro Biomasse blieb auch in bFGF-produzierenden Zellen über mindestens acht Stunden im Rahmen der Meßgenauigkeit konstant, d. h. es gab in diesem Zeitraum einen Anstieg von 6% (bei der Summe der Integrierten Intensitäten aller Spots von Coomassie-

35

Da Proteine unterschiedliche Anteile an Methionin enthalten, können die Bildungsgeschwindigkeiten mit dem Methioninanteil normiert werden. Dazu wird jede Bildungsgeschwindigkeit durch den Methioninanteil ihres Proteins geteilt und durch die Summe aller durch ihren Methioninanteil geteilten Bildungsgeschwindigkeiten dividiert. Ferner muß die Gesamttranslation durch den Methioninanteil aller Proteine, die zum jeweiligen Zeitpunkt gebildet werden, gewichtet mit ihrem Anteil an der Gesamttranslation dividiert und auf den entsprechenden Wert zum Referenzzeitpunkt normiert werden. Es wurden die Methioninanteile für 25 repräsentative Proteine aus ihrer Sequenz ermittelt und die Normierungen durchgeführt. Für unbekannte Proteine wurde der Methioninanteil des mittleren E. coli-Proteins eingesetzt. Diese Normierung hatte keinen Einfluß auf die Form der ermittelten Kinetiken, die Absolutwerte der Bildungsgeschwindigkeiten werden um weniger als 20% verändert. Eine Ausnahme bildet bFGF; der Einfluß der Normierung auf die berechnete bFGF-Bildungsgeschwindigkeit wird im Ergebnisteil erwähnt.

3.4. Protein-Analytik

41

gefärbten 2D-Gelen, nicht gezeigt). Es wurde der Anteil eines Proteins an der Gesamtmenge unter Annahme eines Proteingehalts der Biomasse von 550 mg g-1 (Ingraham et al., 1983) in spezifische Proteinkonzentrationen umgerechnet36. Die Gesamtproduktion an Proteinen änderte sich nach Induktion (s. Ergebnisse). Die Anteile an der Gesamtproduktion wurden mit der „relativen Gesamttranslation“ und mit einem Schätzwert der vor Induktion geleisteten Gesamtproduktion multipliziert. Die vor Induktion geleistete Gesamtproduktion wurde wie folgt abgeschätzt: Zum Wachstum mit einer spezifischen Rate von 0,12 h-1 muß bei einem Proteingehalt von 550 mg g-1 66 mg g-1 h-1 an Protein produziert werden. Bei 30°C macht der Protein-Turn-over weniger als 1% h-1 aus (Walace und Holms, 1986) und wird vernachlässigt. 3.4.3 Blotting Die Proteine können von den Gelen zum Sequenzieren auf Polyvinylidenfluorid-(PVDF)Membranen übertragen werden. Dazu wurden die Membranen (Immobilon-PSQ, Millipore) zunächst in Methanol getränkt, in Milli-Q gewaschen und mindestens 20 min in TowbinPuffer (s. Tabelle 11) geschüttelt. Die Gele wurden unmittelbar nach dem Elektrophoreselauf ebenfalls in Towbin-Puffer äquilibriert. Die Elektroden der Trans-Blot SD-Kammer (Biorad) wurden mit Milli-Q gereinigt. Auf zwei Schichten Filterpapier wurde die Membran, dann das Gel und wieder zwei Schichten Filterpapier gelegt. Das Filterpapier war kurz in TowbinPuffer getaucht worden. Aus jeder Filterpapierschicht wurden Luftblasen entfernt. Tabelle 11: Lösungen für das Blotten und Färben von PVDF-Membranen Towbin-Puffer 25 mM Tris 192 mM Glyzin 20% (v/v) Methanol pH 8,3

0,1% (w/v) 1% (v/v) 40% (v/v)

Coomassie-Lösung Coomassie Blue R-250 Essigsäure Methanol filtrieren

Zur Übertragung wurde eine Spannung von 15 V angelegt. Nach 42 min war der Transfer beendet. Für gefärbte Gele sollte die dreifache Zeit angesetzt werden (Ranganathan und De, 1996). Die Membran wurde drei Minuten in einer Coomassie-Lösung in Methanol (s. Tabelle 11) gefärbt und in 50% Methanol entfärbt.

36

Gemäß nicht gezeigten Messungen nach Bradford liegt der Proteingehalt zwischen 470 und 540 mg g-1. Die Variationen zwischen den Proben, die zu verschiedenen Kultivierungszeiten genommen wurden, waren nicht signifikant größer als die Abweichungen bei Dreifachbestimmung einzelner Proben.

42

3. Material und Methoden

3.4.4 Radioaktive Markierung Zum Markieren wurden 100 µL aus dem Bioreaktor entnommene Zellsuspension (mit einer Optischen Dichte von etwa 100) mit 10 µL 35S-Methionin (1,5 Ci mL-1) für 1 min bei 42 °C in einem Eppendorf-Gefäß inkubiert, dann wurde mit nicht-markiertem Methionin (10 µL 100 mM) eine Minute gechased, um das Vollenden angefangener Peptidketten zu ermöglichen. Die Reaktion wurde auf Eis gestoppt; dort wurden die Proben auch bis zum Zentrifugieren (5 min bei 22000 rpm) gelagert. Das Pellet wurde in 600 µL Waschpuffer (Tabelle 12) resuspendiert, und wie oben zentrifugiert. Die Pellets wurden bei -70 °C eingefroren und zum Weiterverarbeiten in 600 µL Waschpuffer aufgenommen. Die Zellen wurden wie unmarkierte Proben aufgeschlossen und in lösliche und unlösliche Zellfraktionen getrennt. Für 2D-Gele wurden sowohl gleiche Aktivitäten wie gleiche Biomassen aufgetragen. Tabelle 12: Waschpuffers bei Experimenten mit radioaktiver Markierung Waschpuffer 10 mL 5 mg 100 mg ad 100 mL

100 mM MgCl2 in Tris/HCl (700 mM, pH 7,2) PABA (p-Aminobenzamidindihydrochlorid) L-Methionin Aqua dest.

0,5 mL 100 mM Phenylmethansulfonsäurefluorid in Dimethylsulfoxid a a)

3.5

bei –20 °C lagern und unmittelbar vor Gebrauch zugeben

Analytik biologischer Größen

Biomasse und Optische Dichte Die Optische Dichte (OD600) wurde an geeignet verdünnten Proben mit einem Spektrophotometer Novaspec II (Pharmacia, Freiburg) bei einer Wellenlänge von λ = 600 nm gemessen. Zur Bestimmung der Biotrockenmasse wurden je 1 mL Probe in tarierten EppendorfGefäßen 4 min bei 18000xg zentrifugiert und nach Entfernen des Überstandes bis zur Gewichtskonstanz in einem Vakuumtrockenschrank bei etwa 270 Pa und 42°C getrocknet. Keimzahl Die Lebendkeimzahl unter selektiven (mit Ampicillin als Selektionsmarker für plasmidtragende Zellen) und unter nicht-selektiven Bedingungen wurde mit einem „Spiral Plater, Model C“ (Spiral Systems, Inc., Cincinnati, Ohio) bestimmt. Die Probe wurde in 10er Schritten in 50 mM Phosphatpuffer pH 7 verdünnt. Für jede Probe wurden je drei unabhängige Verdünnungsreihen hergestellt. Das Gerät trägt die Proben auf Agarplatten auf. Nach Inkubation wurden die Kolonien nach einem vom Hersteller mitgelieferten Schema ausgezählt.

3.5. Analytik biologischer Größen

43

Proteinbestimmung nach Bradford Zur Proteinbestimmung wurden 25 µL geeignet mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7) verdünnter, aufgeschlossener Zellen mit 1,25 mL Bradfordreagenz versetzt und nach 30minütiger Inkubation bei Raumtemperatur bei einer Wellenlänge von λ = 595 nm gegen Reagenz vermessen. Die Extinktionen wurde über Kalibrierung mit Rinderserumalbumin im Konzentrationsbereich 0,05 – 0,5 g L-1 umgerechnet. Tabelle 13: Bradfordreagenz zur Proteinbestimmung Bradfordreagenz 100 mg Coomassie Brilliant Blue G 250 10 mL Ethanol 100 mL 85% Phosphorsäure ad 1 L Aqua dest.

Plasmidmassenanteil Aus 2 mg Biomasse (Kultivierungsproben) wurde die Plasmid-DNA mit dem Jet-Star 2.0System (Genomed) nach dem Prinzip der alkalischen Lyse gemäß der Vorschrift des Lieferanten extrahiert37 und über Anionenaustauscher-Säulen von chromosomaler DNA getrennt. Die Plasmid-DNA wurde in 50 µL Wasser aufgenommen. Davon wurden 10 µL mit 1 µL des Restriktionsenzyms BamH1 (Biolabs, 20 units pro Milliliter) im 20 µL-Ansatz für 2 h bei 37°C linearisiert. Die Reaktion wurde mit 5 µL 6x Loading Buffer (Takara Biomedicals; 30% Glycerin, 30 mmol EDTA, 0,03% Bromphenolblau, 0,03% Xylencyanol) beendet. Nach Separation auf 1%igen Agarosegelen wurden die mit 55 ppm Ethidiumbromid gefärbten Gele gescannt. Die Intensität der pλFGFB- bzw. pCytexP1-Bande wurde auf die der pKextexV126Bande bezogen, um unterschiedliche Ausbeuten bei der Extraktion auszugleichen. Die Quantifizierung erfolgte über einen λ-Ladder-Marker (Genomgröße 40 kb), von dem 0,5 µg aufgetragen waren. Die Intensität der Marker-Banden wurde über der Lauflänge aufgetragen; aus dieser Kalibrierung wurde die Intensität einer Bande an der Position des Zielplasmids, das 0,5 µg DNA entsprach, berechnet („Norm- Intensität“). Damit konnte aus der Intensität jeder Bande mit den Plasmidgrößen von pλFGFB 5,5 kb, pCytexP1 5 kb und pKextexV126 9,7 kb die Menge an DNA bestimmt werden nach DNA-Menge = GrößeZielplasmid/GrößePhage λ * 0,5 µg * Banden-Intensität/Norm-Intensität (4)

37

Die Proben wurden mit jeweils gleichen Mengen an TG1 pKextexV126 versetzt. Das Referenzplasmid erlaubte die Bestimmung und Berücksichtigung der Effizienz der Plasmid-Extraktion.

44

3. Material und Methoden

Gesamttranslation Die Gesamtproduktion an Protein pro Biomasse wurde auf zwei Wegen bestimmt. 6 µL auf OD = 16 verdünnte, aufgeschlossene Zellsuspension wurde mit 2 mL Scintillationsflüssigkeit im Scintillationszähler vermessen. Gleiche Biomassen (etwa 100 µg) wurden auf ein 1DSDS-PAGE-Gel aufgetragen; die Summe der Bandenflächen nach Autoradiographie wurde als Maß für die Proteinproduktion genommen. Beide Methoden ergeben nur relative Werte. Es wurde auf den entsprechenden Wert vor dem Temperatursprung bezogen, um eine „relative Gesamttranslation“ zu erhalten. Beide Verfahren haben systematische Fehlerquellen: beim Scintillationszähler wird freies Methionin in der Zelle mitgezählt. Tendenziell werden also zu hohe Werte erhalten. Da aber die Aminosäure-Pools in der Zelle allgemein sehr klein sind und mit nicht-markiertem Methionin gechased wurde, ist dieser Fehler minimal. Auf dem Gel werden sehr große und sehr kleine Proteine nicht erfaßt. Ferner wird an intensiv gefärbten Stellen die Proteinmenge unterschätzt. Diese Methode liefert tendenziell zu kleine Werte. Die erhaltenen Daten beider Methoden stimmen sehr gut überein. Die systematischen Fehler sind gegen die zufälligen Fehler vernachlässigbar. 3.6 Online Bestimmung der Biomasse Das zur pH-Regelung zudosierte Ammoniumhydroxid ersetzte das zur Biosynthese aufgenommene Ammonium. Wegen der Konstanz des Biomasse-Ausbeutekoeffizient bezogen auf Ammoniak YX/NH3 = 7,2 g g-1 war der Laugeverbrauch proportional zur Biomasse; die Wachstumsrate konnte online aus diesen Meßwerten bestimmt werden. Allerdings kam es bei Acetatbildung zu Abweichungen. Diese wurde wie folgt berücksichtigt: Wurde Acetat gebildet und Ammonium zur pH-Korrektur dazutitriert, stieg die Leitfähigkeit. Ohne Acetatbildung fiel die Leitfähigkeit während der Fed-Batch-Phase näherungsweise linear. Extrapoliert man den linearen Abfall und bildet die Differenz ∆κ zur gemessenen Leitfähigkeit, ist diese der Acetatkonzentration proportional (Einsatz in Abb. 6). Die Biomasse berechnet sich demgemäß nach BM online = Y X/NH 3 ⋅ c NH 3 ⋅ M Lauge − ∆κ ⋅ k HAc ,

(5)

wobei cNH3 die Ammoniak-Konzentration der Lauge, MLauge die zur pH-Korrektur verbrauchte Laugemasse, ∆κ die Differenz zwischen linear aus der Fed-Batch-Phase I extrapolierter und tatsächlich gemessener Leitfähigkeit und k HAc =

MWNH 3 1000g ⋅ 40mS cm −1 MWHAc ⋅ c NH 3

(6)

3.6. Online Bestimmung der Biomasse

45

ist. Darin ist MW das Molekulargewicht von Ammoniak bzw. Essigsäure und der erste Bruch ein empirisch bestimmter Proportionalitätsfaktor für Masse von Acetat pro Leitfähigkeitsdifferenz. Letzterer ist nicht konstant; die Leitfähigkeitsänderung hängt von der Ionenstärke und der Viskosität der Kulturbrühe ab. Die beschriebene Korrektur genügte am Ende der Kultivierung (s. Abb. 6) nicht mehr. Hier kam es auch zu Glukoseakkumulation. Glukose kann wegen der vielen Hydroxidgruppen Ionen mit einer Hülle ähnlich einer Hydrathülle umgeben, wodurch der effektive Radius erhöht und die Leitfähigkeit herabgesetzt wird. Dieser Effekt wird durch eine durch den Zucker erhöhte Viskosität der Kulturbrühe verstärkt. Die Leitfähigkeit entspricht nicht mehr der Acetatkonzentration mit dem vorgegebenen Faktor. Solange die Acetatbildung aber nicht zum Absterben der Bakterien und nachfolgend zur Glukoseakkumulation im Medium führt, kann mit dem empirischen Anhaltswert gearbeitet werden. 30

4000 -1

∆κ /mS cm

26

2000

Zeit /h 29

40 10

30

0 32

20 1000 10

0 10

15

20

25

30

-1

-1

0 23

20

Leitfähigkeit κ /mS cm

Biomasse /g

10

Acetat /g L

20

3000

50

30

0 35

Zeit /h

Abb. 6: Abschätzung der Biomasse aus Laugeverbrauch und Leitfähigkeit Symbole: Biomasse (Zelldichte mal Kulturvolumen), durchgezogene Linie: BiomasseSchätzung (dünn: aus Laugeverbrauch; dick: unter Berücksichtigung der Leitfähigkeit), gestrichelte Linie: Leitfähigkeit (dick: gemessen, dünn: linear aus der FedBatch-Phase I extrapoliert). Einsatz: Acetatkonzentration (Symbole) und Differenz ∆κ zwischen gemessener und extrapolierter Leitfähigkeit (Linie)

46

3. Material und Methoden

3.7 Berechnungen von Stoffströmen Die Kohlendioxidbildungsrate (CER) QCO2 in mol L-1 h-1 erhält man aus den Stoffmengenanteilen x von Kohlendioxid und Sauerstoff in der Begasungs- (Index in) und in der Abluft (Index out) mit den in Tabelle 14 angegebenen Symbolen: QCO 2 =

(

)

out in in  V  xCO 2 ⋅ 1 − xO 2 − xCO 2 in ⋅ − xCO  out out 2 N ⋅ V  1 − xO2 − xCO 2 

(

)

(7)

Die spezifische Kohlendioxidbildungsrate qCO2 bestimmt sich aus QCO2, Kulturvolumen V und der Biomasse. Tabelle 14: Einheiten und Bezeichnungen der Symbole in Gleichungen 7 und 8 V

x

N

V

L h-1 Begasungsrate

mol mol-1 Stoffmengenanteil

L mol-1 Molvolumen (Ideales Gas)

L Kulturvolumen

Analog ist die Sauerstoffaufnahmerate (OUR) QO2 in mol L-1 h-1 QO2

(

)

out in in V  in xO2 ⋅ 1 − xO 2 − xCO 2  = ⋅  xO − . out N ⋅ V  2 1 − xOout2 − xCO  2

(

)

(8)

Aus dem Zufütterungsmassenstrom F(t) in g h-1 (Zufütterungslösung pro Zeit nach Gleichung 2) errechnet man die Zufütterungsrate rS in mol h-1 (Kohlenstoff pro Zeit) mit der Glukose-Konzentration der Zufütterungslösung SF in g g-1 nach: rS = F (t ) ⋅ S F ⋅

6 mol . 180 g

(9)

Aus der online bestimmten Biomasse berechnet sich die spezifische Wachstumsrate µ nach

µ=

d BM online . BM online ⋅ dt

(10)

Mit den Biomasse-Werten konnten die spezifischen Ströme qS, qX und qCO2 bestimmt werden. Meßwerte (Rinas, 1998) zeigten, daß sich der Kohlenstoffanteil cC/X der Bakterien während der Kultivierung nicht wesentlich ändert. Mit cC/X = 0,42 g g-1 und der molaren Masse von Kohlenstoff MWC = 12 g mol-1 wurde die Wachstumsrate als molare Größe (Mol in die Biomasse eingebauter Kohlenstoff pro Gramm Biomasse pro Stunde) ausgedrückt. Man bekommt für die spezifische Biomasse-Bildungsrate qX (in mol g-1 h-1) qX = µ ⋅

0,42 g g −1 . 12 g mol −1

(11)

3.8. Parameteridentifikation

47

Die spezifische Glukose-Aufnahmerate qS in mol g-1 h-1 ist, solange keine Glukose im Medium akkumuliert, gleich der spezifischen Zufütterungsrate: qS = rS BM online .

(12)

3.8 Parameteridentifikation Modelle, bestehend aus einem Differentialgleichungssystem oder aus der analytischen Lösung dieses Systems, geben als Modellausgang y die gesuchten Größen als Funktion der Zeit und einer Schätzung Pˆ für den Parametervektor. Das Residuum J, das die Abweichung der Modellsimulation y zu den Meßwerten yM zu den Probenahmezeitpunkten ti angibt, ist definiert als N

(( )

)

2 J = ∑ y t i , Pˆ − y M (t i ) σ i2 . i =1

(13)

Es wurde angenommen, daß die Standardabweichung der Messung 10% des simulierten Wertes beträgt, also σi = y(ti, Pˆ )*0,1. Es wurde mit einem Nelder-Mead-SimplexAlgorithmus derjenige Parametervektor bestimmt, der das Residuum J minimiert.

48

4. Ergebnisse und Diskussion

4 Ergebnisse und Diskussion 4.1

Akkumulation von löslichem und aggregiertem bFGF

4.1.1 Typischer Verlauf einer Standardkultivierung Die Hochzelldichtekultivierung war unterteilt in eine Trophophase bei 30°C (Batch-Phase und anschließende Fed-Batch-Phase I) und eine Ideophase bei 42°C, in der das Zielprotein bFGF akkumulierte (Fed-Batch-Phase II). In der Batch-Phase wurde die vorgelegte Glukose verbraucht. Dabei nahm die Biomasse mit der maximalen spezifischen Wachstumsrate von µ = 0,46 h-1 zu (Abb. 7). Die Zufütterung in der Fed-Batch-Phase I ermöglichte Wachstum mit einer konstanten Rate von 0,12 h-1, bis eine Optische Dichte von 100 (entsprechend einer Zelldichte von 45 g L-1) erreicht war. Dann wurde durch einen Temperatursprung von 30°C auf 42°C die bFGF-Produktion induziert. Die zur pH-Regelung verbrauchte Laugemasse war zur Biomasse proportional und wurde zur online Berechnung spezifischer Größen benutzt. Als Beispiel ist in Abb. 7 die spezifische Wachstumsrate aufgetragen. In den Fed-Batch-Phasen war die Zelldichte so hoch, daß trotz stoßweiser Laugedosage ein brauchbares Signal erhalten wurde. In den Fed-Batch-Phasen wurde die zugefütterte Glukose vollständig aufgenommen, die Glukose-Konzentration lag unterhalb von 0,1 g L-1. In der Fed-Batch-Phase I nahm die Biomasse mit der eingestellten Wachstumsrate zu, die spezifische Glukose-Aufnahmerate38 war somit konstant. Beim Temperatursprung wurde die Zufütterung mit verringerter Wachstumsrate µ set neu gestartet. Nach dem Temperatursprung war die tatsächliche Wachstumsrate kleiner als die eingestellte (µ ≈ 0,05 h-1 < µ set = 0,08 h-1), wodurch die spezifische Glukose-Aufnahmerate mit der Zeit anstieg (Abb. 7). Dies ist unerwünscht, da die Zufütterungsrate klein gehalten wurde, um den „bakteriellen Crabtree-Effekt“ zu vermeiden. Trotz der höheren spezifischen Glukose-Aufnahmerate kam es in Standardkultivierungen auch fünfzehn Stunden nach der Induktion weder zur Akkumulation von Glukose noch zur Exkretion von Acetat (nicht gezeigt). Das Verfahren ist also für die Kultivierung zu hohen Zelldichten auch parallel zur Produktion rekombinanter Proteine geeignet. Die Ursache für die kleine Wachstumsrate nach Induktion war ein verstärkter Katabolismus, erkennbar am Anstieg der spezifischen Kohlendioxidbildungsrate nach dem Temperatursprung (Abb. 7 unten), die in einer Abnahme des Ausbeutekoeffizienten Y X S resultierte.

38

Da im Glukose-limitierten Fed-Batch keine Glukose im Medium akkumuliert, ist hier die Glukose-Aufnahmerate gleich der spezifischen Zufütterungsrate.

4.1. Akkumulation von löslichem und aggregiertem bFGF Fed-Batch I

Batch

49 Fed-Batch II

2,5

0,5

2,0

Biomasse /kg

spezifische Wachstumsrate µ /h

-1

0,6

0,4 1,5 0,3 1,0 0,2 0,5

0,1

0,0

35

10

8 25 6

20 15

4

10 2 5 0 0

5

10

15

20

Kultivierungszeit t /h

25

30

0 35

-1

spez. Kohlendioxidbildungsrate qCO2 /mmol g h

-1

30

-1

spez. Zufütterungsrate /cg g h

-1

Glukose-Konzentration /g L bzw.

-1

0,0

Abb. 7: Typischer Verlauf einer Standardkultivierung Oben: Biomasse (Kreise) und Wachstumsrate (Quadrate); Linien: jeweilige Größe aus der zur pH-Regelung verbrauchten Lauge berechnet. Unten: Glukose-Konzentration (Rauten) und spezifische Glukose-Zufütterungsrate (dicke Linie; 1 cg = 0,01 g); spezifische Kohlendioxidbildungsrate (dünne Linie). Trophophase (Batch- und Fed-BatchPhase I, µ set = 0,12 h-1) bei 30°C, Fed-Batch-Phase II bei 42°C, µ set = 0,08 h-1.

50

4. Ergebnisse und Diskussion

In Batch- und Fed-Batch-Phase I war kein bFGF nachzuweisen39. Das verwendete Promotorsystem ist bei 30°C vollständig reprimiert. Unmittelbar nach Induktion stieg die spezifische bFGF-Konzentration40 steil an. Begünstigt durch die hohe Temperatur und durch Proteinspezifische Eigenschaften aggregierte ein Teil des Produkts und bildete Einschlußkörper; die Ausbeute an dem leichter aufzureinigenden und daher erwünschten löslichen bFGF wurde dadurch verringert. Typische Verläufe der spezifischen Konzentrationen von gesamtem bFGF und den löslichen bzw. unlöslichen Fraktionen nach Induktion sind in Abb. 8 gezeigt. Zunächst wurde schnell ausschließlich unlösliches bFGF gebildet. Nach einer halben Stunde verlangsamte sich die Akkumulation des aggregierten bFGFs, gleichzeitig trat zunehmend lösliches bFGF auf. Die spezifische Konzentration des gesamten bFGFs nahm nach vier Stunden kaum noch zu; es wurde ein stationäres Niveau erreicht. Der Anteil löslichen bFGFs betrug dann etwa 40%.

50

bFGF /mg g

-1

40

30

20

10

0 0

2

4

6

8

10

12

14

tind /h

Abb. 8: Spezifische bFGF-Konzentration in einer Standardkultivierung aus Coomassie-gefärbten 1D-SDS-PAGE-Gelen bestimmt. Kreise: gesamt, Quadrate: löslich, Dreiecke: unlöslich.

39

Die Nachweisgrenze bei Coomassie-gefärbten Gelen liegt bei etwa 2 mg g-1. Auch bei zehnfach empfindlicherer Silberfärbung ist vor Induktion keine bFGF-Bande zu erkennen. 40 Der Begriff „Konzentration“ ist hier ungenau, weil auf die Masse, nicht auf das Volumen der Biomasse bezogen wird. Korrekt wäre vom Massenanteil zu sprechen.

4.1. Akkumulation von löslichem und aggregiertem bFGF

51

4.1.2 Vergleich von Kultivierungen mit unterschiedlichen Zufütterungsraten Der Anstieg der spezifischen Kohlendioxidbildungsrate war Ursache für einen verringerten Ausbeutekoeffizienten Y X S . Der erhöhte Anteil des Katabolismus verstärkte die in FedBatch-Prozessen bestehende Glukoselimitierung. In zwei Kultivierungen wurde daher nach dem Temperatursprung mit 1,4fach bzw. 2fach höherer spezifischer Rate als in der Standardkultivierung zugefüttert. In der Kultivierung mit doppelter Zufütterungsrate kam es wie erwartet wegen des bakteriellen Crabtree-Effekts schnell zur Exkretion von Acetat, welches das Zellwachstum inhibierte. In beiden Kultivierungen war der Anteil der zu Kohlendioxid veratmeten an der zugefütterten Glukose, YCO2 S , kleiner als in Standardkultivierungen (Tabelle 19 im Anhang). Dies führte jedoch nicht zu einer höheren Biomasse-Ausbeute. Dieser Aspekt wird in Abschnitt 4.3.1 betrachtet. Die Akkumulation von bFGF erfolgte bei höherer Zufütterungsrate schneller (Abb. 9). Bei doppelter Zufütterungsrate wurden etwa zwei Stunden nach Induktion über 50 mg g-1 an bFGF erreicht. Die Nettoakkumulation stoppte noch früher als in Standardkultivierungen.

60 50

bFGF /mg g

-1

40 30 20 10 0 0

2

4

6

8

tind /h

Abb. 9: Spezifische bFGF-Konzentrationen in Kultivierungen mit verschiedener Zufütterungsrate Volle Symbole: gesamtes bFGF; offene Symbole: lösliches bFGF; Linien: Modell (s. 4.1.3). Kreise, durchgezogenen Linie: Standardkultivierung; Quadrate, gestrichelte Linie: Kultivierung mit 1,4facher Zufütterungsrate; Dreiecke, gepunktete Linie: Kultivierung mit doppelter Zufütterungsrate.

52

4. Ergebnisse und Diskussion

In Batch-Experimenten mit maximaler Glukose-Aufnahmerate wurden 80 mg g-1 innerhalb von anderthalb Stunden akkumuliert (nicht gezeigt). In einer „Kultivierung mit variabler Zufütterung“, in der die spezifische Zufütterungsrate nach Induktion schrittweise gesteigert wurde, akkumulierte bFGF mit gleicher Kinetik wie in den Standardkultivierungen (nicht gezeigt). Die Geschwindigkeit der bFGF-Bildung stieg also mit der Glukose-Aufnahmerate während der Induktion; spätere Beschleunigung der Fütterung wirkte sich nicht mehr auf die bFGF-Bildung aus. Je schneller die bFGF-Bildung erfolgte, desto höhere spezifische Konzentrationen wurden erreicht; allerdings stoppte die Nettoakkumulation auch um so früher. Auch Strandberg et al. (1994) fanden, daß im Fed-Batch die Produktion eines rekombinanten Proteins unter der Kontrolle des λPR-Promotors deutlich langsamer verläuft als in Satzkultivierung, dafür aber nachhaltiger erfolgte. Derselbe Effekt zeigt sich auch, wenn die Temperatur die Bildungsgeschwindigkeit bei einem chemisch-induzierbaren System beeinflußt (Surek et al., 1991). Auf die am Kultivierungsende vorliegende Konzentration an löslichem bFGF hatte die Zufütterungsrate in der Fed-Batch-Phase II allerdings keinen Einfluß. Es wurde in allen drei Kultivierungen etwa 20 mg g-1 an löslichem bFGF gebildet. Dies wird durch das folgende Modell beschrieben. 4.1.3 Einfaches Modell für die Faltung von bFGF 4.1.3.1 Annahmen des Modells Die Produktqualität von bFGF, d. h. die spezifischen Konzentrationen an löslichem und unlöslichem Produkt, soll durch ein Modell quantitativ beschrieben werden. Es wird, wie von Kiefhaber et al. (1991) vorgeschlagen, von einem einfachen Modell, das die Renaturierung in vitro beschreibt, ausgegangen. Dabei wird eine kinetische Konkurrenz zwischen Faltung in die native Konformation und Aggregation in Einschlußkörpern angenommen (s. Abb. 10). Dieser Ansatz wird um eine Bildungsgeschwindigkeit 41 qP des rekombinanten Proteins ergänzt. Die verwendeten Parameter sollen zeitlich konstant sein. Ein solches „Modell“ vernachlässigt mechanistische Details und entzieht sich daher Verallgemeinerungen. Es kann aber dazu dienen, die Produktion und Faltung von bFGF kompakt zu beschreiben. Mit den erhaltenen Parametersätzen kann man Kultivierungen, bei denen die Prozeßbedingungen variiert wurden, einfach vergleichen.

41

Die Umrechnung zwischen spezifischer Konzentration in mg g-1 und der Bildungsgeschwindigkeit in mmol g-1 h-1 erfolgte mit dem Molekulargewicht von bFGF bezogen auf Kohlenstoff Mr = 22,45 g mol-1.

4.1. Akkumulation von löslichem und aggregiertem bFGF

53

Abb. 10: Kinetisches Modell für die Konkurrenz zwischen Faltung und Aggregation Ein primäres Translationsprodukt I wird mit der Bildungsgeschwindigkeit qP gebildet und faltet mit der Geschwindigkeitskonstanten kN zum nativen Protein N oder aggregiert nach einer Kinetik n-ter Ordnung mit der Geschwindigkeitskonstanten kA irreversibel zu Einschlußkörpern A. Natives Protein N wird mit der Degradationsgeschwindigkeitskonstanten kD abgebaut. Erweitert nach Kiefhaber et al. (1991). Modelle dieser Art wurden unter Annahme einer exponentiell mit der Zeit abfallenden Bildungsgeschwindigkeit für bFGF untersucht (Hoffmann, 1996). Es zeigte sich, daß zur genauen Bestimmung der Parameter in den ersten beiden Stunden nach Induktion Probenabstände von höchstens fünf Minuten erforderlich sind. Für den weiteren Verlauf ist stündliche Beprobung ausreichend. In einem ersten Experiment war dort die Reaktionsordnung der Aggregation zu eins bestimmt worden. Messungen zeigten, daß der Anteil der bFGF-Bildungsgeschwindigkeit an der gesamten Proteinsynthese nach Induktion über der Zeit nahezu konstant war (s. 4.2.3.2). Außerdem trat Degradation von bFGF auf. Es wird hier deshalb eine konstante Bildungsgeschwindigkeit qP und simultane Degradation löslichen bFGFs (Konformer N in Abb. 10) mit der Degradationsgeschwindigkeitskonstante kD angenommen. In den Experimenten akkumulierte lösliches bFGF verzögert, und im Modell errechnet man einen sofortigen Anstieg des primären Translationsprodukts I. Zur Beschreibung der Meßdaten muß angenommen werden, daß das primäre Translationsprodukt unlöslich42 ist oder in einer Konformation vorliegt, die es während der Probenaufarbeitung aggregieren läßt. In vitro faltet bFGF sehr langsam (Estapé und Rinas, zur Veröffentlichung eingereicht); es kann sich beim primären Translationsprodukt also um eine nur teilweise gefaltete Zwischenstufe handeln. Die Struktur von bFGF gibt einen Anhaltspunkt, daß eine relative stabile Faltungszwi-

42

Es gibt nur wenige Arbeiten, die Solubilisierung eines unlöslich gebildeten Proteins durch experimentelle Befunde erhärten. Leontyeva und Ugarova (1996) fanden, daß die Luciferase aus Glühwürmchen in E. coli in inaktiver Form gebildet und in einem DnaK- und ATP-abhängigen Prozeß in vivo in die aktive Konformation gefaltet wird. Auch bei der Rückfaltung von Proteinen in vitro kann die Faltung von einen transienten Aggregat ausgehen, das sehr schnell gebildet wird (Silow und Oliveberg, 1997).

54

4. Ergebnisse und Diskussion

schenstufe43 auftritt. Diese könnte leicht intermolekulare Wechselwirkungen eingehen und während der Probenaufarbeitung aggregieren. Das primäre Translationsprodukt I nimmt mit der Geschwindigkeitskonstanten kN die native Konformation N an, die der Aggregation während der Aufarbeitung nicht mehr zugänglich ist. Die unlösliche Fraktion von bFGF wird im Modell durch zwei Konformationen, I und A, repräsentiert. Da entweder I unlöslich ist oder während der Aufarbeitung aggregiert, kann über die Kinetik der irreversiblen Aggregation zu A nichts ausgesagt werden. Bei der Parameterschätzung44 findet man, daß die Aggregationsgeschwindigkeitskonstante kA den Wert Null annimmt. Das Modell vereinfacht sich also, da irreversible Aggregation nicht berücksichtigt zu werden braucht45. Mit konstanter Bildungsgeschwindigkeit können der anfänglich steile Anstieg und der spätere Stopp der Nettoakkumulation von bFGF nur errechnet werden, wenn man den Abbau des verzögert akkumulierten, löslichen nativen bFGFs annimmt 46. Es wird zwar allgemein angenommen, daß native Proteine proteolytisch stabil sind. In Batch-Experimenten wurde aber nach einem Temperatursprung von 42°C auf 30°C ein schneller Rückgang der volumetrischen Konzentration an löslichem bFGF gefunden (nicht gezeigt). Die Stabilisierungsenergie von bFGF ist gering; mit 21 kJ mol-1 (Estapé et al., 1998) liegt sie im unteren Bereich der für globuläre Proteine gefundenen Werte (45±15 kJ mol-1, Lorimer, 1996). Demnach kann auch natives bFGF bei 42°C leicht denaturiert werden und ist der Proteolyse zugänglich. 4.1.3.2 Parameteridentifikation Das das Modell beschreibende Differentialgleichungssystem läßt sich analytisch lösen (s. 7.2). Die Parameter wurden durch Anpassung der Modellsimulation an die Meßwerte für lösliches und gesamtes bFGF bestimmt. Sie sind in Abb. 11 gegeben. Die gefundenen Parameterwerte stiegen linear mit der Zufütterungsrate an. Wie in der Einleitung ausgeführt, findet man für die Bildungsgeschwindigkeit rekombinanter Proteine über der Wachstumsrate oft einen Verlauf mit einem Maximum, denn bei steigender Wachstumsrate nimmt die Plasmidkopienzahl ab, während die Translationsgeschwindigkeit

Einer der zwölf β-Stränge des bFGFs hat von seiner Primärsequenz her eine starke Neigung zur Bildung einer α-Helix (M. Prevost, persönliche Mitteilung). Möglicherweise stellt die Umwandlung dieser Helix in die im nativen bFGF vorliegende Struktur den limitierenden Schritt da, der die langsame Faltung von bFGF erklärt. 44 Identifikation des Parametersatzes, der die Differenz zwischen Modellsimulation und Meßwerte für die spezifischen Konzentrationen von gesamtem und löslichem bFGF minimiert; vgl. Gleichung 13. 45 Dies schließt irreversible Aggregation nicht aus; sie wird lediglich durch das Modell nicht beschrieben. 46 Würde das primäre Translationsprodukt I abgebaut, errechnete man einen linearen Anstieg der Gesamtmenge an bFGF, was nicht mit den Meßdaten übereinstimmt. Ein zusätzlicher Abbau dieses Konformers kann aber nicht ausgeschlossen werden. 43

4.1. Akkumulation von löslichem und aggregiertem bFGF

55

steigt. Da in den hier verglichenen Kultivierungen die Wachstumsrate vor Induktion gleich war, wird angenommen, daß dies auch auf die Plasmidkopienzahl zutrifft. Nach Induktion blieb der Plasmidmassenanteil nach einem kurzen Anstieg konstant (s. 4.2.3.1). Da die Plasmidkopienzahl im Vergleich der Kultivierungen keine Rolle spielt, steigt die Bildungsgeschwindigkeit qP von bFGF linear mit der Zufütterungsrate. 2,5

2,5

2,0

2,0 1,5 1,5 1,0 1,0 0,5

0,5

0,0 2

4

6

8

10

Geschwindigkeitskonstanten /h

spezifische Bildungs-

-1

geschwindigkeit qP /mmol g h

-1

-1

3,0

0,0 14

12 -1

spezifische Zufütterungsrate qS /mmol g h

-1

Abb. 11: Parameterwerte für das Modell in Abb. 10 Die Parameter sind qP (Quadrate, Bildungsgeschwindigkeit des primären Translationsprodukts I), kN (Kreise, Faltungsgeschwindigkeitskonstante von I zum nativen bFGF N) und kD (Dreiecke, Degradationsgeschwindigkeitskonstante des nativen bFGFs N). Die Aggregationsgeschwindigkeitskonstante war kA = 0 h-1. Linien: Ausgleichsgeraden (dicke Linie vgl. Gleichung 16). Die Gleichung für die Substrataufnahme qS =

qX q + P + mS′ Y X′ S YP S

(14)

stellt ein einfaches Modell für den Einfluß der Prozeßvariablen „Zufütterungsrate“ (bzw. der Glukose-Aufnahmerate qS) auf die Bildungsgeschwindigkeit qP eines rekombinanten Proteins dar. Die Biomasse-Bildungsrate qX in mmol g-1 h-1 (Kohlenstoff in der Biomasse pro Biomasse und Zeit) ist proportional zur spezifischen Wachstumsrate. Die Ausbeutekoeffizienten für Biomasse und Protein sind etwa gleich ( Y X′ S ≈ YP S , vgl. Anmerkung 94 auf S. 117). Für

56

4. Ergebnisse und Diskussion

den „wahren“ Ausbeutekoeffizienten Y X′ S wird der Wert, der für die Fed-Batch-Phase I gefunden wird (s. 4.3.1.1), angenommen: Y X′ S = 0,585 mol mol-1. Bei streng wachstumsabhängiger Produktion, wie sie für rekombinante Proteine gefunden wird (Shin et al., 1998), kann man den Zusammenhang zwischen Wachstumsrate und Bildungsgeschwindigkeit des rekombinanten Proteins nach Leudeking und Piret (1959) angeben: qP = α ⋅ q X

(15)

Setzt man Gleichung 15 in Gleichung 14 ein und formt um, erhält man qP =

α ⋅ Y X′ S ⋅ (qS − mS′ ) . 1+ α

(16)

Vergleicht man mit der bei der Parameterschätzung gefundenen Korrelation zwischen qS und qP (Abb. 11), erhält man aus der Steigung m für den Koeffizienten α = m/( Y X′ S - m) = 0,600 und mit dem Achsenabschnitt b m′S = -b/m = 2,27 mmol g-1 h-1 für den Erhaltungsenergiebedarf. Mit diesen Parametern lassen sich aus qP auch die erwarteten Wachstumsraten der einzelnen Kultivierungen errechnen (s. Tabelle 19 im Anhang). Sie liegen um 60% höher als die gemessenen Wachstumsraten. Weitere Substrat- und Energie-verbrauchende Prozesse, die im „Modell“ (Gleichung 14) nicht berücksichtigt werden, scheinen eine Rolle zu spielen. Die tatsächliche Bildungsgeschwindigkeit von bFGF war höher als abgeschätzt (vgl. 4.2.3.2) und wird durch schnelle Degradation maskiert werden. Die zusätzliche Bildung und der ATPabhängige Abbau von bFGF stellen eine Energiesenke dar. Rekombinante Proteine, die langsam oder nicht stabil in die native Konformation falten, lösen die Hitzeschockantwort auch bei niedrigen Temperaturen aus. Dies führt zu verstärkter Bildung von Chaperonen und Proteasen, die weitere Ressourcen verbraucht (vgl. 4.2.8). Man kann erwarten, daß die Stärke der Hitzeschockantwort zumindest mittelbar von der Bildungsgeschwindigkeit des rekombinanten Proteins abhängt. Die Geschwindigkeitskonstanten kN für Faltung und kD für Degradation hängen linear von der Bildungsgeschwindigkeit qP ab. Eine lineare Beziehung zwischen Degradationsgeschwindigkeitskonstante und Bildungsgeschwindigkeit war von Wood und Peretti (1991) auch für die mRNA eines rekombinanten Proteins gefunden worden. Wenn man so will, sind diese Geraden ein „Modell“ für die Reaktion der Zellen auf die Produktion rekombinanter Proteine.

4.1. Akkumulation von löslichem und aggregiertem bFGF

57

4.1.3.3 Voraussagen des Modells Der Anstieg der bFGF-Konzentrationen, sowohl für lösliches als auch gesamtes bFGF, ist also mit schnellerer Zufütterung steiler. Auf die am Kultivierungsende vorliegende Konzentration hatte dies allerdings einen geringeren Einfluß: die Konzentration des gesamten bFGFs stieg nur sehr wenig mit der Zufütterungsrate (Tabelle 15 und Abb. 9 auf S. 51), die Konzentration löslichen bFGFs gar nicht; sie war unabhängig von der Zufütterungsrate konstant. Tabelle 15: Akkumulierte Mengen an bFGF als Grenzwerte der Modellgleichungen Grenzwerte der Modellgleichungen für große t als Maß für die stationäre Konzentration an bFGF. Relative Zufütterungsrate bezogen auf die Standardkultivierung, Konzentrationen in mg g-1. G…gesamtes bFGF, N…natives bFGF. Grenzwert

Gleichung

lim (G )

 1 1   ⋅ q P  +  k N + µ kD + µ 

t →∞

lim (N ) t →∞

lim (N G ) t →∞

relative Zufütterungsrate 1x 1,4x 2x 48,2 48,1 50,8

qP kD + µ

21,4

19,4

21,1

kN + µ kN + µ + kD + µ

0,44

0,40

0,41

Man kann die lineare Beziehung zwischen den Modellparametern und der Zufütterungsrate benutzen, um über den experimentell abgedeckten Bereich hinaus zu extrapolieren. Diese Daten können nur als Trend gewertet werden, weil das Modell nicht genügend mechanistische Details für eine exakte Vorhersage einschließt. Die spezifischen Konzentrationen an gesamtem bzw. löslichem bFGF als Funktion der Zufütterungsrate sind in Abb. 12 gezeigt. Eine Steigerung der Zufütterungsrate auf das Fünffache der Rate in der Standardkultivierung würde die Konzentration an gesamten bFGF nur um 19% erhöhen, die an löslichem sogar nur um 13%. Diese Zufütterungsraten sind praktisch nicht zu erreichen, da schon bei doppelter Zufütterungsrate Acetat bis zu inhibierenden Konzentrationen exkretiert wurde. Eine Reduktion der Zufütterungsrate dagegen verlangsamt zwar die Akkumulation von bFGF, die Produktion hält aber deutlich länger an (vgl. die Linien für tind = 8 h und tind = 15 h in Abb. 12). Selbst bei gegenüber der Standardkultivierung um 35% reduzierter Zufütterungsrate würden – nach den Simulationen – noch 80% der in der Standardkultivierung gefundenen Konzentration an löslichem bFGF nach 15 h erreicht werden. Da die Konzentration an gesamtem bFGF über der Zufütterungsrate steiler ansteigt als die Konzentration löslichen bFGFs (Abb. 12), erreicht man gleichzeitig eine starke Reduktion der Konzentration an unlöslichem bFGF, also eine Vermeidung der Bildung von Einschlußkörpern bei kleiner Zufütterungsrate. Daneben erwartet man eine bessere Vitalität der Zellen, da weniger Ressourcen für die Produktion und

58

4. Ergebnisse und Diskussion

ATP-abhängige Degradation von bFGF benötigt werden47. Der Ansatz, gegen die Intuition bei verringertem Ausbeutekoeffizienten die Zufütterungsrate zu reduzieren, könnte erfolgversprechend sein. Betont werden muß, daß der Einfluß der reduzierten Zufütterung auf den physiologischen Zustand der Wirtszelle nicht in dieses Modell inkorporiert wurde und daher nicht vorausgesagt werden kann.

55 50

bFGF /mg g

-1

40 30 20 10 0 2

4

6

8 -1

qS /mmol g h

10

12

-1

Abb. 12: Maximale spezifische bFGF-Konzentration als Funktion der spezifischen Zufütterungsrate Simulationen mit dem in Abb. 10 gezeigtem Modell unter Benutzung der linearen Beziehung zwischen Zufütterungsrate und Modellparametern (s. Abb. 11). Durchgezogene Linien: lösliches bFGF; gestrichelte Linien: gesamtes bFGF. Dünne Linien: Werte acht Sunden nach Induktion, dicke Linien: Werte 15 Stunden nach Induktion. In Standardkultivierungen war der Biomasse-Ausbeutekoeffizient nach dem Temperatursprung wegen der gestiegenen Kohlendioxidbildungsrate klein. Eine Steigerung der Zufütterungsrate resultierte in einer schnelleren Akkumulation von bFGF; die am Kultivierungsende erreichte spezifische Konzentration wurde allerdings kaum beeinflußt. Insbesondere zeigte sich kein Effekt auf die Ausbeute an löslichem Produkt. Die Akkumulation löslichen bFGFs wird nicht durch die Zufütterungsrate limitiert.

47

Für eine gegebene Kultivierungsdauer (die deutlich größer ist als das optimale Kultivierungsende – das sei die Zeit, bei der 95% der stationären Konzentration an löslichem bFGF erreicht sind) fällt der Anteil der akkumulierten an der insgesamt gebildeten bFGF-Menge hyperbolisch mit der Zufütterungsrate. Bei schneller Zufütterung wird also ein Großteil des gebildeten bFGFs abgebaut.

4.1. Akkumulation von löslichem und aggregiertem bFGF

59

4.1.4 Pulse-Chase-Experimente Um die Kinetik der Faltung bzw. Aggregation besser zu verstehen, wurden Pulse-ChaseExperimente durchgeführt. Zellen wurden zu mehreren Zeitpunkten nach der Induktion (tind = 0 h bis 2 h) dem Reaktor entnommen, und deren Proteine wurden mit radioaktivem Methionin markiert; die Verteilung von bFGF auf lösliche bzw. unlösliche Zellfraktion wurde zu verschiedenen Zeiten (tChase = 0 h bis 2 h) nach der Zugabe eines Überschusses an nichtradioaktivem Methionin bestimmt. Während dieser Experimente konnte die limitierende Glukose-Zufütterung wie im Reaktor nicht aufrechterhalten werden. Es wurde daher ohne Glukose und bei einer GlukoseKonzentration von 10 g L-1 gemessen. Der Sauerstofftransfer während dieser Experimente war unzureichend. Energieabhängige Prozesse waren daher gestört; insbesondere stoppte die Proteinsynthese, wie durch die konstante bFGF-Konzentration auf Coomassie-gefärbten Gelen erkennbar war. Zusätzlich zu den „energiefreien“ Versuchen wurden daher Pulse-ChaseExperimente in Schüttelkolben durchgeführt. Hier lag ein Substrat- und mutmaßlich auch Energieüberschuß vor. Beide Ansätze unterscheiden sich von den Bedingungen im Bioreaktor, wo Substrat und Energie verfügbar waren, wenn auch in limitierendem Ausmaß. Die Ergebnisse werden deshalb nur qualitativ diskutiert. Die Bildungsgeschwindigkeit von bFGF nahm nach der Induktion zu, die Menge an markiertem bFGF stieg mit dem Zeitpunkt der Markierung, tind. In den „energiefreien“ Experimenten sank die Konzentration an gesamtem bFGF während der Chase-Zeit um weniger als 20%. Es war ein deutlicher Übergang des löslichen bFGFs in die unlösliche Zellfraktion mit der Chase-Zeit tChase festzustellen. Dieser Trend war in unmittelbar nach der Induktion markierten Zellen ausgeprägt, wies eine abnehmende Tendenz auf und war in zwei Stunden nach der Induktion markierten Zellen nicht mehr festzustellen. Chaperone, also Proteine, die die Aggregation unvollständig gefalteter Proteine verhindern, werden als Teil der Hitzeschockantwort induziert. Zunächst ist die Aggregation ausgeprägt, weil unzureichende Chaperon-Konzentration vorliegen. Wenn die Chaperon-Konzentration mit der Zeit steigt, wird die Neigung zur Aggregation verringert. Wie in Abb. 8 gezeigt, ist in der ersten halben Stunde nach Induktion in Coomassie-gefärbten Gelen kein akkumuliertes lösliches bFGF nachzuweisen. Radioaktiv markiertes bFGF sollte also in dieser Zeit vollständig aggregieren. Tatsächlich blieb mindestens 45% des markierten bFGFs löslich. In den „energiefreien“ Experimenten stoppte die Proteinsynthese nach kurzer Zeit; die bFGFKonzentration nahm nicht mehr zu. Fortlaufende Proteinsynthese verstärkt die Aggregation bestehender Proteine (z. B. Lee et al., 1990; Klein und Dhurjati, 1995). Chaperone binden an

60

4. Ergebnisse und Diskussion

unvollständig gefaltete Proteine, um deren Aggregation zu verhindern. Bei unzureichender Chaperon-Verfügbarkeit aggregiert ein Teil der instabilen Proteine; die Aggregation stoppt, wenn die Chaperon-Konzentration ausreicht, die verbleibenden Proteine zu stabilisieren. Fortlaufende Proteinsynthese erhöht die Menge potentiell an Chaperone bindender Proteine und verstärkt die Aggregation. Da in den „energiefreien“ Experimenten die Proteinsynthese stoppte, war die Aggregation weniger vollständig als im Bioreaktor. Unter Energieüberschußbedingungen im Schüttelkolben trat ein anderer Effekt in den Vordergrund: die Konzentration unlöslichen bFGFs blieb während der Chase-Zeit konstant, während die des löslichen und damit die des gesamten bFGFs abnahm. Als Teil der Hitzeschockantwort werden auch ATP-abhängige Proteasen induziert. Die Zellen bauen den Überschuß an unvollständig gefalteten Proteinen, die nicht durch die verfügbaren Chaperone stabilisiert werden können, ab. In den „energiefreien“ Experimenten überwog die Aggregation die Degradation. Die Aggregation von bFGF zeigt also nicht nur einen Mangel an Chaperonen, sondern auch an Proteasen oder Energie an, da die zur Aggregation neigenden Proteine nicht durch die ATP-abhängigen Proteasen abbauen werden können. Eine verringerte Degradation führte zu verstärkter Aggregation. Das zeigte auch ein Experiment mit E. coli BL21 pλFGFB, bei dem die Protease Lon, die im Wildtyp für den größten Teil des Proteinabbaus verantwortlich ist, eliminiert wurde. In BL21 pλFGFB akkumulierte bFGF im Schüttelkolben zu einer höheren Konzentration als in TG1 pλFGFB; die Konzentration an löslichem bFGF war allerdings nur halb so groß wie in TG1 pλFGFB (s. 4.2.5). Im Bioreaktor aggregierte bFGF in der ersten halben Stunde nach Induktion quantitativ, danach akkumulierte auch lösliches bFGF. Zunächst herrschte eine starke Energielimitierung vor, die sich im Laufe der Zeit entspannte. Dies bestätigen die online gemessenen Atmungsraten (Abb. 7). Sie stiegen unmittelbar nach der Induktion steil an, um den erhöhten Energiebedarf zu decken; später waren sie etwa proportional zur Glukose-Zufütterungsrate. Zellen im Bioreaktor liegen in energetischer Hinsicht zwischen den geschilderten Extremen in den Pulse-Chase-Experimenten. Eine gewisse, wenn auch limitierende Energieverfügbarkeit wird erlauben, daß ein Teil des gebildeten bFGFs abgebaut wird, während besonders unmittelbar nach der Induktion ein anderer Teil des bFGFs in Einschlußkörper aggregiert. Um diese Einflußfaktoren in ein Modell inkorporieren zu können, müssen Informationen über die Verfügbarkeit von Chaperonen und Energie herangezogen werden. Für die Chaperone müssen nicht nur die Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen bekannt sein, sondern

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

61

auch die für zelluläre Prozesse benötigten und die freien Anteile. Dazu müßten die relativen Affinitäten zu zelleigenen Proteinen und zu bFGF und etwas über die zugrundeliegenden Mechanismen bekannt sein. Energiebereitstellung und –verbrauch sind sehr schnelle Prozesse. Der Turn-over des Energieträgers ATP pro Minute übersteigt seine Konzentration um ein Vielfaches. Zur Abschätzung der Energieverfügbarkeit, also der Veränderung der ATP-Konzentration, müssen die Energiebildungs- und –verbrauchsraten mit sehr hoher Genauigkeit bekannt sein. Da das eingeführte Modell die Bildung und Faltung von bFGF gut beschreibt, wird es für viele Anwendungen genügen, auf diesen einfachen Ansatz zurückzugreifen. Wenn man die für die Akkumulation von bFGF bedeutsamen Prozesse erkennen will, muß man den physiologischen Zustand des Wirts E. coli besser verstehen. Besonderes Augenmerk muß dabei auf die Hitzeschockantwort und auf den Metabolismus gerichtet sein. Für den Gesamtprozeß sind daneben Faktoren wie die Plasmidstabilität und die Vitalität des Bakteriums, d. h. seine Fähigkeit zu Wachstum und Proteinsynthese, entscheidend. Im folgenden wird der physiologische Zustand von E. coli unter Produktionsbedingungen durch die Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen wichtiger Gruppen von Proteinen charakterisiert. Zur vereinfachten Prozeßüberwachung werden online verfügbare Meßdaten mit dem physiologischen Zustand korreliert. 4.2

Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

4.2.1 Überblick Wichtig für die aktuelle Vitalität der Bakterien unter Produktionsbedingungen ist die „Aktivität“ der zelleigenen Proteine48, die sich aus der verfügbaren Menge (potentielle Aktivität) und durch die Konzentrationen von Effektoren (und Substraten) ergibt. Einen ersten Überblick über die Konzentrationen einer Vielzahl von Proteinen erlaubt die zweidimensionale Gelelektrophorese, bei der das Proteom nach Isoelektrischem Punkt und Molekulargewicht getrennt wird. Die Proteine werden mit Coomassie-Farbstoff angefärbt, und die Färbeintensität als Maß für die Proteinmenge genommen. Noch sensitivere Indikatoren für Veränderungen der Proteinzusammensetzung sind die Bildungsgeschwindigkeiten der Proteine, wie sie mit radioaktiver Markierung, anschließender 2D-Elektrophorese und Exposition auf einen Film gemessen werden. Die Schwärzung des Films ist das Maß für die Bildungsgeschwindigkeit. In Abb. 13 sind solche Filme für Standard- und Kontrollkultivierung einander gegenübergestellt. Dem Reaktor wurden nach verschiedenen Zeiten (s. Legende) Zellen entnommen, deren 48

Der Begriff Aktivität soll hier nicht nur den Stoffumsatz von Enzymen, sondern allgemein die Wirksamkeit von Proteinen bezeichnen.

62

4. Ergebnisse und Diskussion

Proteine radioaktiv markiert und aufgetrennt. Zunächst soll qualitativ auf einige Entwicklungen hingewiesen werden. Vor dem Temperatursprung (erste Spalte in Abb. 13) gab es keine wesentlichen Unterschiede in den Protein-Bildungsgeschwindigkeiten zwischen Standard- (unten) und Kontrollkultivierung (oben). Das bFGF-Gen ist vollständig reprimiert; seine Anwesenheit alleine beeinträchtigt die Zellen nicht. Nach dem Temperatursprung wurde es mit großer Geschwindigkeit exprimiert. Wegen seines hohen pI-Wertes von 9,6 und seines geringen Molekulargewichts von 16 kDa ist bFGF links unten auf den Filmen zu finden. Die Bildungsgeschwindigkeit von bFGF durchlief ein Maximum. Es wurde ein deutlich saureres Fragment von bFGF gebildet. Mit dem Temperatursprung wurde die Hitzeschockantwort induziert. Schon fünf Minuten nach dem Temperatursprung waren maximale Raten erreicht. In der Kontrollkultivierung war die Hitzeschockantwort nach einer Stunde im wesentlichen abgeschlossen, die Bildungsgeschwindigkeiten fast auf das Vorinduktionsniveau zurückgegangen; in der Standardkultivierung dagegen wurden bis zum Kultivierungsende große Mengen an Hitzeschockproteinen synthetisiert. Eine Ausnahme bildeten die kleinen Hitzeschockproteine IbpA und IbpB, die sowohl in der Standard- als auch in der Kontrollkultivierung nur fünf Minuten nach dem Temperatursprung mit hohen Bildungsgeschwindigkeiten synthetisiert wurden. Während der Hitzeschockantwort wurden die meisten zellulären Proteine mit verringerter Bildungsgeschwindigkeit synthetisiert, d. h. in der Kontrollkultivierung erholten sich die Bildungsgeschwindigkeiten mit der Zeit, während sie in der Standardkultivierung niedrig blieben. Diesem Trend überlagert ist in der Kontrollkultivierung ein langsamer Abfall der Haushaltsprotein-Bildungsgeschwindigkeiten. Dieser Verlauf ist als Anteil der „Haushaltsproteine“ an der Gesamtproteinsynthese in Abb. 14 dargestellt. Dafür wurden die Bildungsgeschwindigkeiten von 19 Proteinen, von denen die identifizierten Proteine Teil des Proteinproduzierenden Systems, metabolische Enzyme oder im Periplasma lokalisiert sind, aufsummiert und auf die Gesamtproteinsynthese zum jeweiligen Zeitpunkt bezogen. Sie machten in der Fed-Batch-Phase I mehr als 50% der Gesamtproteinsynthese aus. Der wichtigste Vertreter dieser Gruppe ist das in TG1 bei 30°C am stärksten gebildete Protein, das periplasmatische Dipeptid-Bindungsprotein (DppA, vgl. Abb. 27 auf S. 93). Im Gegensatz dazu wurden einige wichtige katabolische Enzyme wie SdhA und LpdA sogar vorübergehend induziert (s. vor allem die dritte Spalte in Abb. 13). Die Bildungsgeschwindigkeiten anderer metabolischer Proteine wie der Isocitrat-Dehydrogenase (IcdE) und der Malat-Dehydrogenase (Mdh) stiegen in beiden Kultivierungen wieder auf das Niveau der Fed-Batch-Phase I.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

63

Tabelle 16: Legende zu Abb. 13 (umseitig) Code a)

Gen blab) blab) cIb)

Protein β-Laktamase Prä-Protein der β-Laktamase Plasmid-kodierter Repressor cI

cI‘ b)

C-terminal verkürzte Form von cI

clpB c) clpB c)

ClpB (Hsp F84.1) ClpB‘ (Hsp E72.0)

F84.1 E72.0

dnaK c) dnaK c)

DnaK (Hsp70) DnaK-Fragment

B66.0 --

dnaJ c) dppA g)

DnaJ periplasmatisches DipeptidBindungsprotein Tagatose-Bisphosphat-Aldolase (EC 4.1.2.-) GrpE HtpG Inclusion-Body-Protein A Inclusion-Body-Protein B

H36.5 G59.9

gatY h) grpE c) htpG c) ibpA c) ibpB c) icdE h) lpdA h)

-------------

H29.0 i) B25.3 C62.5 G13.5 C14.7 C43.8 B50.5

mdh h)

Isocitrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.42) Dehydrolipamid-Dehydrogenase j) (EC 1.8.1.4) Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.37)

mobA c) mobB c)

GroEL GroES (Cpn10)

B56.5 C15.4

sdhA h)

F60.3

tnaA h)

Succinat-Dehydrogenase FlavoproteinUntereinheit (EC 1.3.99.1) Tryptophanase (EC 4.1.99.1)

tsf

Elongationsfaktor EF-Ts

F30.2

G46.5 C30.7/C31.6

N-terminale Sequenz HPETLVKVKD d)

STKKKPLTQEQLE DARRLKA STKKKPLTQEQLE DARRLKA d)

NDQGAEDQRQAL KK e) GKIIGIDLGT RFQDEEVQRDVSI MPFKIIA f) d)

KTLVYCSEGS MYVVSTKQMLNN AQRGGY d) d) d)

MRNFDLSPLYRSA IGFD MESKVVVPAQ STEIKTQVVV MKVAVLGAAGGI GQAALLL AAKDVKFGND MNIRPLHDRVIVK RKEVETK MKLPVREFDA MENFKHLPEPFRI RVIEPVK AEITASLVKELRE RTGAGMM

d) tuf Elongationsfaktor EF-Tu E42.0 a) alphanumerischer Code nach Pedersen et al. (1978) aus der Datenbank Eco2db6 b) Plasmid-kodiertes Protein c) Hitzeschockprotein d) über Position auf dem Gel identifiziert e) ab Position 149 f) ab Position 75 g) periplasmatisches Bindungsprotein h) metabolische Enzyme i) kein Datenbankeintrag; alphanumerischer Code aus der Gel-Position abgeschätzt j) E3-Untereinheit von Pyruvat- und α-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplex

64

4. Ergebnisse und Diskussion

Abb. 13: Autoradiogramme von 2D-Gelen nach Markierung der Proteine mit 35S-Methionin Zu den angegebenen Zeiten wurden 100 µL Probe aus dem Reaktor eine Minute mit 10 µL 35SMethionin (1,5 Ci mL-1) markiert, eine Minute mit 10 µL 100 mM nicht-radioaktivem Methionin gechased und auf Eis gestoppt. Gleiche Biomassen wurden durch zweidimensionale Gelelektrophorese getrennt. Der Isoelektrische Punkt steigt von rechts nach links, das Molekulargewicht von unten nach oben. Oben: Kontrollkultivierung, unten: Standardkultivierung. Erste Spalte: vor dem Temperatursprung, zweite Spalte: fünf Minuten nach dem Temperatursprung, dritte Spalte: eine Stunde nach dem Temperatursprung, vierte Spalte: fünf Stunden nach dem Temperatursprung.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

65

Abb. 13: Autoradiogramme von 2D-Gelen (Fortsetzung) Dünne graue Pfeile: metabolische Enzyme (Abkürzungen s. Tabelle 16); dicke graue Pfeile: Elongationsfaktoren; dicker schwarzer Pfeil: DppA; dünne schwarze Pfeile: Hitzeschockproteine; weiße Pfeile: Plasmid-kodierte Proteine.

66

4. Ergebnisse und Diskussion

Die Gesamtproteinsynthese war in beiden Kultivierungen nach dem Temperatursprung größer als vorher (vgl. Abb. 25 auf S. 89), ging dann aber in der Standardkultivierung stark zurück (Abb. 25 oder vierte Spalte in Abb. 13). Dort waren am Ende nur noch wenige Proteine hergestellt worden, außer den Hitzeschockproteinen vor allem Plasmid-kodierte Proteine. Das sind neben bFGF die β-Laktamase (bla) und der Repressor cI, die in je zwei Varianten auftraten. In der Kontrollkultivierung wurden die letztgenannten Proteine einige Stunden nach dem Temperatursprung stark induziert.

Anteil "Haushaltsproteine" /%

60 50 40 30 20 10 0 -1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

tind /h

Abb. 14: Anteil der „Haushaltsproteine“ an der Gesamtproteinsynthese Bildungsgeschwindigkeiten von 18 Proteinen49, die in der Fed-Batch-Phase I mehr als 50% der Gesamtproteinsynthese ausmachten, aufsummiert und auf die Gesamtproteinsynthese zum jeweiligen Zeitpunkt bezogen. Offene Symbole: Kontrollkultivierung, volle Symbole: Standardkultivierung. Die einzelnen Proteingruppen werden im folgenden detaillierter beschrieben. Bei den Zahlenangaben ist zu beachten, daß nicht alle Proteine gleiche Aminosäurezusammensetzung aufweisen und daher nicht gleichmäßig mit Coomassie (das an basische Aminosäuren bindet) angefärbt werden bzw. nicht gleich viel Methionin einbauen. Man kann den Methioninanteil identifizierter Proteine bei der Normierung berücksichtigen. Dies ändert nichts am Verlauf der Kurven; die Zahlenangaben können aber um bis zu 20% variieren. Da dies etwa die Größe des Meßfehlers ist, wurde der Methioninanteil nicht berücksichtigt. Das Augenmerk liegt bei den

49

aus dem Protein-produzierenden System die Elongationsfaktoren EF-Ts und EF-Tu, aus dem Periplasma: DppA, OppA, MglB, LivJ, RbsB und als metabolische Enzyme: GatY, GlpK, IcdE, Mdh; daneben sieben unidentifizierte Proteine mit ähnlichem Verlauf.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

67

folgenden Betrachtungen auf den Zeitverläufen der einzelnen Bildungsgeschwindigkeiten; die Zahlenangaben sind eher als Größenordnung oder Orientierungshilfe zu verstehen. 4.2.2 Proteinsyntheseleistung als Maß für die Vitalität 4.2.2.1 Gesamttranslation und Protein-produzierendes System Die während der Markierungsperiode eingebaute Radioaktivität wurde quantifiziert und auf den Wert, der für die Fed-Batch-Phase I vor dem Temperatursprung ermittelt wurde, bezogen. In der Kontrollkultivierung war diese „relative Gesamttranslation“ nur unmittelbar nach dem Temperatursprung erhöht; sie erreichte ein Maximum nach 15 min. Nach einer Stunde war das Ursprungsniveau erreicht und wurde bis zum Ende beibehalten (Abb. 15). Der Verlauf der zusätzlichen Proteinsynthese entspricht genau der Bildung der Hitzeschockproteine (s. 4.2.3). In der Kontrollkultivierung wurden die Hitzeschockproteine zum Teil zusätzlich zu den „Haushaltsproteinen“ gebildet.

relative Gesamttranslation

3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

tind /h

Abb. 15: Relative Gesamttranslation nach dem Temperatursprung Geschlossene Symbole: Standardkultivierung, offene Symbole: Kontrollkultivierung. Summe der während der Markierungsperiode in Proteine inkorporierten Radioaktivität, bezogen auf den Wert vor dem Temperatursprung; gemessen als counts per minute pro Biomasse bzw. als Summe der Peakflächen eines exponierten 1D-SDS-PAGEGels, auf dem gleiche Kulturvolumina pro Probe aufgetragen waren, bezogen auf die Zelldichte (mit gleichem Ergebnis).

68

4. Ergebnisse und Diskussion

In der Standardkultivierung, wo mit dem Temperatursprung die bFGF-Synthese vom starken λPRPL-Promotor induziert wurde, sprang die relative Gesamttranslation innerhalb einer halben Stunde auf das 2,5fache des Wertes in der Fed-Batch-Phase I. Zwei Stunden nach Induktion begannen die Zellen, ihre Translationstätigkeit zu verringern. Extrapoliert man den steilen Abfall über das Kultivierungsende (tind = 5 h) hinaus, erwartet man 5,5 h nach Induktion keine Proteinsynthese mehr (Abb. 15). Das Protein-produzierende System (PPS) umfaßt neben den ribosomalen Proteinen die Initiations- und Elongationsfaktoren der Proteinsynthese, die tRNA-Synthetasen und die Untereinheiten der RNA-Polymerasen. Die Synthese der PPS-Proteine ist strikt reguliert, die Verhältnisse der Bildungsgeschwindigkeit der einzelnen Proteine sind konstant (Bremer und Denis, 1996). Wegen der linearen Abhängigkeit der PPS-Protein-Bildungsgeschwindigkeiten von der Wachstumsrate wurden die meisten von ihnen in der Fed-Batch-Phase I (µ = 0,12 h-1) mit so geringer Bildungsgeschwindigkeit hergestellt, daß sie kaum nachzuweisen sind. Relativ gut meßbar sind der Elongationsfaktor EF-Ts und ein Protein, das von der Position und Menge her sehr wahrscheinlich der Elongationsfaktor EF-Tu ist50. In allen Kultivierungen waren die Bildungsgeschwindigkeiten der Elongationsfaktoren in der ersten Stunde nach dem Temperatursprung gering. In der Kontrollkultivierung stiegen sie wieder, fielen danach aber langsam ab (vgl. Trendlinien in Abb. 16), während in der Standardkultivierung die Bildungsgeschwindigkeiten der Elongationsfaktoren auf dem niedrigen Niveau blieben. Diese Verläufe entsprechen denen der „Haushaltsproteine“ in Abb. 14. Bei Induktion der bFGF-Synthese konnten die Zellen ihre Proteinsyntheseleistung erheblich über den bei 30°C erreichten Wert hinaus steigern. Es wurde keine entsprechend gesteigerte Synthese von Proteinen des Protein-produzierenden Systems (PPS) festgestellt. In der Standardkultivierung wurde der mutmaßliche Faktor EF-Tu sofort nach dem Temperatursprung induziert. Für weniger als 5 min lag seine Bildungsgeschwindigkeit um 90% höher als in der Fed-Batch-Phase I. Sie fiel danach aber innerhalb von 30 min auf weniger als 20% der Bildungsgeschwindigkeit bei 30°C (Abb. 16). In der Kontrollkultivierung war die Steigerung mäßiger und der Rückgang langsamer. In beiden Fällen reicht diese kurze Induktion aber nicht aus, um den starken Anstieg der Gesamttranslation zu erklären. Auch die hohe Geschwindigkeit, mit der neue Translationskapazität bereitgestellt werden konnte, schließt zeitaufwendige Neusynthese von Ribosomen als Quelle aus.

50

EF-Tu ist N-terminal acetyliert (s. SwissProt eftu_ecoli), weshalb er nicht durch Sequenzierung identifiziert werden kann. Tatsächlich findet man beim Sequenzieren des großen Spots nur Spuren eines Proteins (die Enolase = 2-Phosphoglycerate-Dehydrogenase), das mit Molekulargewicht und Isoelektrischem Punkt mit dem EF-Tu übereinstimmt (MW 45,4 kDa, pI 5,69 für Enolase, MW 44,1 kDa, pI 5,7 für EF-Tu).

1,5

0,8

1,2

0,6

0,9

0,4

0,6

0,2

0,3 0,0

0,0 0

2

4

6

-1

1,0

Elongationsfaktors EF-Tu /mg g h

1,8

Bildungsgeschwindigkeit des

1,2

-1

69

-1

Elongationsfaktors EF-Ts /mg g h

Bildungsgeschwindigkeit des

-1

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

8

tind /h

Abb. 16: Elongationsfaktoren als Repräsentanten des Protein-produzierenden Systems Kreise: Elongationsfaktor EF-Ts, Dreiecke: Elongationsfaktor EF-Tu; geschlossene Symbole: Standardkultivierung, offene Symbole: Kontrollkultivierung. Kurve: Trend für die Kontrollkultivierung, Gerade: Trend für die Standardkultivierung. Hohe Temperatur kann die Proteinsynthese beschleunigen. Ein Temperatursprung von 30°C auf 42°C gleichzeitig zur Induktion eines rekombinanten Proteins mit IPTG steigert die Proteinsynthese. Sie war gegenüber dem Wirtstamm ohne Plasmid bei 30°C um mindestens den Faktor 3 erhöht (Pilon et al., 1996). Kürzlich berichteten Farewell und Neidhardt (1998), daß sich die Peptid-Verlängerungsrate mit der Temperatur nach dem Arrhenius-Gesetz beschleunigt, und zwar mit der gleichen Aktivierungsenergie wie die Wachstumsrate zwischen 25°C und 37°C. Abweichend von der Wachstumsrate, die bei weiter zunehmender Temperatur langsamer steigt und schließlich steil abfällt, nimmt die Peptid-Verlängerungsrate bis 44°C mit der gleichen Aktivierungsenergie weiter zu (vgl. Abb. 2 in der Einleitung). Da die Anzahl der Ribosomen pro Zelle konstant ist, ergebe sich bei höheren Temperaturen also ein Überschuß an Translationskapazität, der die schnellere Degradation kompensiere. Bei kleinen Temperaturen finden die Autoren nicht-aktive Ribosomen, und zwar wenn die Wachstumsrate Temperatur-bedingt unter 0,1 h-1 fällt (Farewell und Neidhardt, 1998). Bei höheren Wachstumsraten sind 80% der vorhandenen Ribosomen an der Proteinsynthese beteiligt; es wird angenommen, daß sich die anderen Ribosomen im Stadium des Zusammenbaus befinden (Bremer und Denis, 1996). Bei kleinen Wachstumsraten nimmt dagegen ein

70

4. Ergebnisse und Diskussion

Teil der vorhandenen Ribosomen nicht an der Proteinsynthese teil (Referenz 62 in Keener und Nomura, 1996). Der Anteil ribosomaler Proteine am Gesamtprotein einer Zelle hängt linear von der Wachstumsrate ab, außer bei sehr kleinen Wachstumsraten (Keener und Nomura, 1996); dort liegen überproportional viele ribosomale Proteine vor, um eine augenblickliche Anpassung an veränderte Bedingungen zu erlauben. Die nach dem Temperatursprung stark erhöhte Translationskapazität sowohl in Standard- als Kontrollkultivierung ist also nicht auf eine erhöhte Konzentration an Ribosomen zurückzuführen, da die Bildungsgeschwindigkeiten eng mit dem Protein-produzierenden System koordinierter Proteine nach dem Temperatursprung zurückgingen und sich der verringerten Wachstumsrate anpaßten. Es existiert bei der kleinen in der Fed-Batch-Phase I vorliegenden Wachstumsrate aber ein Reservoir nicht-aktiver Ribosomen, die bei Bedarf (also hier der Induktion der Hitzeschockantwort und in der Standardkultivierung zusätzlich der des bFGFs) aktiviert

werden

können.

Daneben

steigert

die

höhere

Temperatur

die

Peptid-

Verlängerungsrate und trägt zur Erhöhung der Translationskapazität nach dem Temperatursprung bei. Die Zelle verfügt auch unter den stark Glukose-limitierten Bedingungen des FedBatchs über Reservekapazität, um auf die Herausforderung des Temperatursprungs angemessen zu reagieren 4.2.2.2 Verlust der Translationskapazität? Nicht nur die Neusynthese von Ribosomen ist beschränkt, sondern man muß bei der Produktion rekombinanter Proteine auch mit dem Abbau schon existierender Ribosomen rechnen. In der Literatur (Dong et al., 1995) wird berichtet, daß bei Produktion rekombinanter Proteine - ähnlich wie bei der stringenten Antwort (Pedersen, 1976; Gallant, 1979; Cahel et al., 1996) und einem Temperatursprung auf letale Temperatur (Referenz 121 in Neidhardt und VanBogelen, 1987) - Ribosomen abgebaut werden und dadurch die Proteinsynthesekapazität der Zellen zurückgeht. Diesen Bedingungen ist gemeinsam, daß die Proteinsynthese gestört ist. Da es unter anderen Bedingungen (Substratmangel) zur Anhäufung untätiger Ribosomen kommt, ist nicht der Stopp der Translation selbst das Signal zur Ribosomenzerstörung. Der Totalverlust der Fähigkeit zur Proteinsynthese tritt schon ein, wenn noch die Hälfte der 16S-rRNA übrig bleibt (Dong et al., 1995). Beim Eintritt in die stationäre Wachstumsphase scheiden E. coli Uracil und andere Nukleobasen aus, die auf einen Abbau stabiler RNA hinweisen (Rinas et al., 1995). In den Hochzelldichtekultivierungen kam es nach dem Temperatursprung ebenfalls zu einem Anstieg der extrazellulären Konzentrationen an Uracil und Xanthin (nicht gezeigt). Dies ist ein indirekter Hinweis, daß es auch bei der Produktion von bFGF zu Ribosomenzerstörung kommen kann.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

71

In der zitierten Referenz (Dong et al., 1995) wird eine linear mit der Zeit fallende Translationskapazität, die vier Stunden nach Induktion zu Null wird, gefunden. Man kann spekulieren, daß sich in der Standardkultivierung hier zwei Effekte überlagern: unmittelbar nach dem Temperatursprung stieg die Translationskapazität wegen der Aktivierung untätiger Ribosomen und der erhöhten Peptid-Verlängerungsrate; nach einiger Zeit nahm die Folge der Ribosomenzerstörung überhand und die Translationskapazität fiel auch etwa linear (Abb. 15). In Anlehnung an die Literatur (Srivastava und Volesky, 1990; Wood und Peretti, 1991; Vind et al., 1993; Laffend und Shuler, 1994) wurde hier angenommen, daß die Proteinsynthese auf der Ebene der Translation limitiert ist. Beispielsweise fällt die Bildungsgeschwindigkeit bei der Produktion eines rekombinanten Proteins von einem sehr starken Promotor, obwohl die Konzentration der entsprechenden mRNA hoch bleibt (Mattanovich et al., 1996). Es soll aber darauf hingewiesen werden, daß bei DnaK-Mangel und höherer Temperatur die β-Untereinheit der RNA-Polymerase zur Aggregation neigt (Hesterkamp und Bukau, 1998). Es kann deshalb parallel zur Produktion von rekombinanten Proteinen, die Chaperone titrieren, eine Limitierung auf Transkriptionsebene nicht vollständig ausgeschlossen werden. Anders als die hier gemessene Gesamttranslation fiel die aus online gemessenen Größen (vgl. 4.3.3.4) abgeschätzte Gesamttranslation nicht ab (nicht gezeigt). Es ist nicht auszuschließen, daß der Rückgang der Methionin-Inkorporation in die Proteine nicht allein auf die Verringerung der Translationsaktivität, sondern auch auf die Reduktion der Methionin-Aufnahme zurückzuführen ist. Die für den Transport von Nährstoffen notwendigen periplasmatischen Proteine werden in den zellfreien Kulturüberstand verloren; ihre intrazellulären Konzentrationen fielen nach dem Temperatursprung stark ab51 (s. 4.2.6). Es kann aufgrund der vorliegenden Daten nicht entschieden werden, ob die Gesamttranslation tatsächlich abfällt oder die Methionininkorporation aufgrund des Verlustes einschlägiger Transportproteine verhindert wird. 4.2.3 Plasmid-kodierte Proteine 4.2.3.1 Plasmidmassenanteil Bei rekombinanten Mikroorganismen ist neben der zu erreichenden Zelldichte die Plasmidstabilität ein entscheidender Faktor für die Produktivität einer Kultivierung. Oft wird in der Literatur von nach der Induktion sinkender Plasmidkopienzahl berichtet. Man versucht durch Selektion mit Antibiotika, den Anteil der plasmidtragenden – und damit potentiell das rekombinante Zielprotein produzierenden – Zellen zu erhöhen. In den hier untersuchten Kon-

51

Analog nimmt bei der stringenten Antwort die RNA-Syntheserate ab; das Ausmaß wird aber überschätzt, da gleichzeitig die Aufnahme der (bei der Messung zugegebenen radioaktiven) Nukleotide verringert wird.

72

4. Ergebnisse und Diskussion

strukten war die β-Laktamase, die den β-Laktamring von Ampicillin spalten kann, als Selektionsmarker kodiert. Durch den Abbau des Antibiotikums liegt zum Zeitpunkt der Induktion kein Antibiotikum mehr vor. Die Plasmidstabilität muß hier sorgfältig beobachtet werden. Entgegen der Erwartung stieg der Plasmidmassenanteil52 nach dem Temperatursprung in allen Kultivierungen an. Dabei verdoppelte sich der Massenanteil des Plasmids pλFGFB an der Biomasse unmittelbar nach Induktion und erreichte ein neues Niveau nach weniger als einer Stunde (Abb. 17). In den Kontrollkultivierungen nahm die Plasmidkopienzahl von pCytexP1 langsamer, aber nachhaltiger zu. In der Kontrollkultivierung lag nach sieben Stunden vier Mal soviel Plasmid-DNA pro Biomasse vor wie in der Fed-Batch-Phase I (Abb. 17).

relativer Plasmidmassenanteil

4,5

3,0

1,5

0,0 -3

0

3

6

9

tind /h

Abb. 17: Relativer Plasmidmassenanteil nach dem Temperatursprung Plasmidmassenanteil (Plasmid-DNA-Masse pro Biomasse) bezogen auf den in der jeweiligen Kultivierung in der Fed-Batch-Phase I vorliegenden Plasmidmassenanteil (zwischen 100 und 130 µg g-1). Volle Symbole: zwei Standardkultivierungen, offene Symbole: Kontrollkultivierung; Trendlinien. Ein Temperatursprung kann eine unvorhergesehene Initiation der Replikation einleiten (Botello und Jimenz-Sanchez, 1997), die unter bestimmten Umständen zu einer Verdopplung der Chromosomenkopienzahl führen kann (Guzman et al., 1988). Da dies auf Veränderung der 52

Hier wurde die Masse der Plasmid-DNA pro Biomasse gemessen. Da sich die Zellen nach Induktion vergrößern, also die Zellzahl pro Biomasse abnimmt, ist der Anstieg der Zahl der Plasmide pro Zelle noch stärker als der Anstieg des Plasmidmassenanteil. Die Veränderung der Größe bzw. der Masse der Einzelzelle kann nicht quantitativ abgeschätzt werden.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

73

Origin-Struktur, die rein thermodynamisch ohne Wechselwirkung mit Proteinen verursacht wird, zurückgeführt wird (Botello und Jimenz-Sanchez, 1997), mag ein ähnlicher Effekt für Plasmide eintreten. Die Plasmidkopienzahl von pCytexP1 und pλFGFB wird durch die Wechselwirkung zwischen zwei RNAs reguliert53. Die Stabilität dieser Wechselwirkung und die Degradationsgeschwindigkeit der RNA I bestimmen die Plasmidkopienzahl und können von der Temperatur abhängen. Der Plasmidmassenanteil für die Kontrollkultivierung über der Wachstumsrate aufgetragen zeigte ab einer Stunde nach dem Temperatursprung einen linearen Verlauf (nicht gezeigt), wie von Bentley et al. (1990) für die Plasmidkopienzahl eines anderen Plasmids beschrieben54. Bei kleiner Wachstumsrate steigt die Plasmidkopienzahl (Seo und Bailey, 1986)55. Da die Bildungsgeschwindigkeiten konstitutiv synthetisierter Plasmid-kodierter Proteine proportional zur Plasmidkopienzahl sind (s. 4.2.3.3), werden zunehmend zelluläre Ressourcen (Translationskapazität, Bausteine und Energie) für die Synthese nicht-wachstumsfördernde Proteine beansprucht, wodurch die Wachstumsrate weiter fällt. Durch diesen „autokatalytischen“ Prozeß nimmt die negative Steigung der Wachstumsrate in der Kontrollkultivierung mit der Zeit zu. Einen Einstieg in diesen Kreislauf kann der bei höherer Temperatur gesteigerte Erhaltungsenergiebedarf verursachen, der bei limitierender Glukose-Zufütterung die Wachstumsrate beim Temperatursprung verringert; daneben wurde ja gleichzeitig zum Temperatursprung die Zufütterungsrate reduziert. Die lineare Beziehung zwischen Wachstumsrate und Plasmidkopienzahl zeigt, daß dieser „autokatalytische“ Prozeß den Rückgang der Wachstumsrate in der Kontrollkultivierung quantitativ erklärt. In der Standardkultivierung verhindert vermutlich der Mangel an freiem DnaK (s. 4.2.4.2) den weiteren Anstieg des Plasmidmassenanteil, da die Faltung einiger an der Replikation beteiligter Proteine, z. B. DnaQ, von DnaK abhängt (Foster und Marinus, 1992).

53

Eine 700 bp lange sogenannte RNAII stellt mit ihrem 3‘-Ende den Primer für die Replikation des Plasmids von ori dar. Eine 108 bp lange RNAI bindet an RNAII und verhindert die Paarung mit der DNA (Helinski et al., 1996). 54 Dort war die Wachstumsrate durch verschiedene Medien und unterschiedliche Antibiotikum-Konzentrationen variiert worden; es wurden jeweils Zellen aus der exponentiellen Phase analysiert. 55 Die Transkriptionsgeschwindigkeit der beiden regulatorischen RNAs (s. Anmerkung 53) nimmt mit der Wachstumsrate ab. Da die Wechselwirkung miteinander einer Kinetik zweiter Ordnung folgt, die der RNAII mit dem Plasmid aber erster Ordnung, wird bei kleiner Konzentration die Initiation der Replikation bevorzugt (Ataai und Shuler, 1987).

74

4. Ergebnisse und Diskussion

4.2.3.2 Bildungsgeschwindigkeit von bFGF Die bFGF-Bildung wurde durch den Temperatursprung auf 42°C schnell induziert. Vor Induktion war keine Synthese nachzuweisen; nachher stieg die Bildungsgeschwindigkeit innerhalb von 15 min auf 45 mg g-1 h-1 (Abb. 18), was gut 30% der Gesamtproteinsynthese entspricht56. Diese Bildungsgeschwindigkeit wurde bis tind = 3 h beibehalten; danach fiel sie ab (extrapolierter Nullpunkt bei tind = 5,5 h). Der Anteil der bFGF-Synthese an der Gesamtproteinsynthese blieb dabei etwa konstant; der Abfall ist auf den Rückgang der Gesamttranslation (s. 4.2.1 oben) zurückzuführen.

50

-1

Bildungsgeschwindigkeit /mg g h

-1

55

40

30

20

10

0 0

1

2

3

4

5

tind /h

Abb. 18: Spezifische Bildungsgeschwindigkeit von bFGF und einem bFGF-Fragment Spezifische bFGF-Bildungsgeschwindigkeit: Kreise: aus Filmen von 2D-Gelen (in mg g-1 h-1), Kreuze: aus Filmen von 1D-Gelen (in willkürlichen Einheiten, vgl. Abb. 25), Trendlinie. Bildungsgeschwindigkeit eines bFGF-Fragments: Quadrate. Das Integral der Bildungsgeschwindigkeit über der Zeit übertraf die gemessenen Konzentrationen akkumulierten bFGFs bei weitem. In den Modellberechnungen ausgehend von den ak-

56

Bei der Berechnung der Bildungsgeschwindigkeiten wurde vorausgesetzt, daß der Methioninanteil aller Proteine gleich ist. Man kann bei der Normierung die Methionin-Anteile der bekannten Proteine berücksichtigen. Für die meisten Proteine verändern sich dadurch die absoluten Werte der Bildungsgeschwindigkeiten um weniger als 20%, die Verläufe bleiben gleich. Da bFGF gegenüber dem mittleren E. coli-Protein einen deutlich geringeren Methioninanteil aufweist und ferner einen Großteil der Proteinsynthese ausmacht, ändern sich die Werte für die Gesamtproteinsynthese und die bFGF-Bildungsgeschwindigkeit mit der Normierung. Die Gesamtproteinsyntheseleistung stiege danach auf maximal 350% des Vorinduktionsniveaus, die bFGFBildungsgeschwindigkeit wäre maximal 100 mg g-1 h-1 und würde 45% der Gesamtproteinsyntheseleistung ausmachen. Mit 1D-SDS-Gelen schätzt man eine maximale bFGF-Bildungsgeschwindigkeit von 70 mg g-1 h-1 ab.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

75

kumulierten Mengen (s. 4.1.3) war für die Standardkultivierung eine konstante Bildungsgeschwindigkeit von 20 - 25 mg g-1 h-1 errechnet worden. Die proteolytische Stabilität von bFGF muß sehr gering sein. Auch ein (vermutlich proteolytisches) bFGF-Fragment mit einem Molekulargewicht von 12 kDa und einem Isoelektrischen Punkt von etwa 8, das eine Stunde nach Induktion mit einer Bildungsgeschwindigkeit von fast 10 mg g-1 h-1 auftrat (Abb. 18), legt diese Interpretation nahe. Der direkte Nachweis von Degradation in Pulse-ChaseExperimenten gelang nur unter bestimmten Bedingungen. Der Abbau von bFGF scheint von der Chaperon- und Energieverfügbarkeit abzuhängen (s. 4.1.4). 4.2.3.3 Konstitutiv synthetisierte Plasmid-kodierte Proteine Die Bildungsgeschwindigkeiten konstitutiv synthetisierter Plasmid-kodierter Proteine nahmen mit steigendem Plasmidmassenanteil zu. Der Repressor cI lag in zwei Formen vor: in einer (hauptsächlich vorkommenden) vollständigen Form, und in einer N-terminal um 16 Aminosäuren verkürzten, etwas saureren Variante. Die Bildungsgeschwindigkeit der verkürzten Form stieg in der Kontrollkultivierung mit zeitlicher Verzögerung von einer Stunde gegenüber der vollständigen Form an. Beide Formen wurden in der Kontrollkultivierung nach dem Temperatursprung überproportional schnell (verglichen mit dem Anstieg der Gendosis) produziert (Abb. 19). Die Bildungsgeschwindigkeit der vollständigen Form des Repressors cI nahm zwölffach schneller zu als der Plasmidmassenanteil57. Neben dem Gendosiseffekt muß eine Regulation vorliegen. Die hohe Temperatur kann die Plasmidtopologie verändern, wodurch die Zugänglichkeit der Promotoren verbessert und eine häufigere Initiation der Transkription erleichtert wird. Es ist bekannt, daß der Grad der (negativen) Superwindungen bei einem Hitzeschock zunehmen (Camacho-Carranza et al., 1995). Allerdings können die Superwindungen bei Energiemangel nicht aufrechterhalten werden (Jensen et al., 1995). Da die Energieladung nach dem Temperatursprung in Standard- und Kontrollkultivierung transient abfiel (A. Kayer, J. Weber, persönliche Mitteilung), kann a priori nicht gesagt werden, welcher Effekt überwiegt. Die schnelle, überproportionale Steigerung der Bildungsgeschwindigkeit von cI in der Kontrollkultivierung legt allerdings nahe, daß der Anstieg des Grads der negativen Superwindungen die Transkription erleichtert58. 57

In der Fed-Batch-Phase I wurde mit einem relativen Plasmidmassenanteil von 1 der Repressor cI mit einer Bildungsgeschwindigkeit von 0,5 mg g-1 h-1 synthetisiert. Die Steigung der Geraden (Bildungsgeschwindigkeit über relativem Plasmidmassenanteil) in Abb. 19 beträgt 6 mg g-1 h-1 pro Plasmidmassenanteil. Bezogen auf die Gendosis wurde der Repressor also zwölffach schneller synthetisiert als in der Fed-Batch-Phase I. 58 Der Repressor cI wird auf dem Plasmid durch seinen natürlichen Promotor kontrolliert (Bolivar et al., 1977). Im Phagen λ wird das Niveau des Repressors cI autoreguliert; cI unterdrückt seine eigene Synthese (Maniatis et al., 1975). Nach dem Temperatursprung beschleunigte sich – wenn die Operatorsequenzen im Plasmid pCytexP1 erhalten sind – die cI-Synthese. Da auch die Synthese der β-Laktamase (s.u.) beschleunigt ist – wenn auch weniger stark als die des Repressors cI – können beide Mechanismen wirksam sein.

4. Ergebnisse und Diskussion

15

-1

Bildungsgeschwindigkeit /mg g h

-1

76

10

5

0 1

2

3

4

relativer Plasmidmassenanteil

Abb. 19: Bildungsgeschwindigkeiten Plasmid-kodierter Proteine über dem relativen Plasmidmassenanteil Werte der Kontrollkultivierung nach dem Temperatursprung. Symbole: Kreise: Repressor cI (voll: vollständige Form, offen: N-terminal um 16 Aminosäuren verkürzte Form), Dreiecke: β-Laktamase (geschlossen: periplasmatische β-Laktamase, offen: Summe aus periplasmatischer und Prä-β-Laktamase). In der Standardkultivierung fiel dieser Effekt geringer aus. Obwohl sich der Plasmidmassenanteil nach dem Temperatursprung verdoppelte, erhöhte sich die cI-Bildungsgeschwindigkeit sehr langsam; die verkürzte Form von cI wurde sogar nur mit konstanter Rate synthetisiert (nicht gezeigt). Vermutlich wird die Synthese durch den enormen Transkriptions- und Translationsbedarf der Hitzeschockproteine und des bFGFs reduziert. Die Konzentration des Repressors blieb in den Standardkultivierungen etwa konstant, in den Kontrollkultivierung stieg sie ab drei Stunden nach dem Temperatursprung auf den dreifachen Wert an (nicht gezeigt). Das zweite konstitutiv synthetisierte Plasmid-kodierte Protein, die β-Laktamase, trat in zwei Formen auf, der prozessierten, periplasmatischen Form und als Prä-β-Laktamase59, bei der das Signalpeptid noch nicht entfernt ist und die im Cytoplasma vorliegt. Die Summe der Bil-

59

Die akkumulierten Mengen sind zu gering für eine N-terminale Sequenzierung. Die Position auf dem Gel (Molekulargewicht 30 – 31 kDa, Isoelektrischer Punkt größer als 6) legen aber die Identifizierung als Prä-βLaktamase nahe. Daß trotz hoher Bildungsgeschwindigkeit kaum Protein akkumuliert, spricht dafür, daß dieses Protein prozessiert wird (nämlich zur reifen, periplasmatischen β-Laktamase).

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

77

dungsgeschwindigkeiten beider Formen war proportional zum Plasmidmassenanteil (für die Kontrollkultivierung s. Abb. 19). Auch hier war die auf die Gendosis bezogene Bildungsgeschwindigkeit nach dem Temperatursprung höher als in der Fed-Batch-Phase I60, was für eine durch die Temperatur veränderte Plasmidtopologie, die die Transkription beschleunigt, spricht. Die Auswirkungen der gestiegenen Bildungsgeschwindigkeiten konstitutiv synthetisierter Plasmid-kodierter Proteine auf den Wirtsorganismus waren in der Kontrollkultivierung ausgeprägter als in der Standardkultivierung, weil der Plasmidmassenanteil nach dem Temperatursprung in der Kontrollkultivierung deutlich stärker anstieg: Die konstitutiv synthetisierten Plasmid-kodierten Proteine machten in der Kontrollkultivierung den Großteil nichtwachstumsfördernder Proteine aus, die für den verringerten Biomasse-Ausbeutekoeffizienten nach dem Temperatursprung verantwortlich sind (s. 4.2.8). Die dadurch kleine Wachstumsrate führte zu einer Erhöhung des Plasmidmassenanteils, die wiederum gesteigerte Bildungsgeschwindigkeiten der konstitutiv synthetisierten Plasmid-kodierten Proteine nach sich zog. Dieser Mechanismus reicht zur quantitativen Beschreibung der Wachstumsrate in der Kontrollkultivierung nach dem Temperatursprung aus (s. 4.2.3.1). Obwohl die Bildungsgeschwindigkeit der β-Laktamase in der Kontrollkultivierung deutlich stärker stieg als in der Standardkultivierung, war die Bildungsgeschwindigkeit der reifen (prozessierten, periplasmatischen) β-Laktamase in beiden Kultivierungen gleich hoch (Abb. 20). Die Bildung reifer β-Laktamase scheint auf der Ebene des Prozessierens, also des Proteinexports, limitiert zu sein. Der Anteil der Bildungsgeschwindigkeit der reifen β-Laktamase an der Summe der Bildungsgeschwindigkeiten von reifer und Prä-β-Laktamase war für die Standardkultivierung deutlich größer als für die Kontrollkultivierung (Abb. 20 unten). In der Standardkultivierung war der Anteil reifer β-Laktamase nach dem Temperatursprung zudem höher als in der Fed-BatchPhase I. Die Zeitverläufe der Anteile reifer β-Laktamase (Abb. 20) glichen in Standard- und Kontrollkultivierung der Kinetik der Hitzeschockantwort (Abb. 23 auf S. 81). Der Export von β-Laktamase hängt bei 42°C von GroEL ab (Kusukawa et a., 1989). GroEL wird in der Standardkultivierung als Teil der Hitzeschockantwort um den Faktor 20 schneller gebildet als in der Fed-Batch-Phase I. Der resultierende Überschuß an GroEL kann die Effizienz oder die

60

Die Steigung der Bildungsgeschwindigkeit über dem relativen Plasmidmassenanteil war dreimal höher als die Bildungsgeschwindigkeit in der Fed-Batch-Phase I bezogen auf den relativen Plasmidmassenanteil von eins, vgl. Anmerkung 57. Dies gilt gleichermaßen für die prozessierte β-Laktamase wie für die gesamte β-Laktamase.

78

4. Ergebnisse und Diskussion

Geschwindigkeit des β-Laktamase-Exports erhöhen. Dadurch stieg der Anteil der reifen β-Laktamase an der produzierten β-Laktamase in der Standardkultivierung auf das Doppelte des Anteils in der Fed-Batch-Phase I (Abb. 20).

-1

8 6

-1

/mg g h

Bildungsgeschwindigkeit

10

4 2

prozessierter Anteil /%

0 100 80 60 40 20 0 0

2

4

6

8

tind /h Abb. 20: Prozessieren der β-Laktamase Geschlossene Symbole: Standardkultivierung, offene Symbole: Kontrollkultivierung. Oben: Bildungsgeschwindigkeit der β-Laktamase, Dreiecke: gesamt, Quadrate: nur periplasmatische β-Laktamase. Dicke Linien: Trendlinien (gestrichelt: gesamte β-Laktamase in der Kontrollkultivierung, durchgezogen: periplasmatische β-Laktamase in beiden Kultivierungen). Unten: Kreise: Bildungsgeschwindigkeit der periplasmatischen β-Laktamase bezogen auf die Bildungsgeschwindigkeit der gesamten β-Laktamase. Trotz des starken Anstiegs der Bildungsgeschwindigkeit stieg die intrazelluläre Konzentration der β-Laktamase in der Kontrollkultivierung erst ab drei Stunden nach dem Temperatursprung. Vorher ging sie in allen Kultivierungen nach dem Temperatursprung leicht zurück

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

79

(Abb. 21). Dies beruhte auf einem Verlust der β-Laktamase aus dem Periplasma in die Um-

relative β-Laktamase-Konzentration

gebung, wie auch für andere periplasmatische Proteine gefunden (s. 4.2.6).

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

tind /h Abb. 21: Relative β-Laktamase-Konzentration nach dem Temperatursprung bezogen auf die in der Fed-Batch-Phase I vorliegende spezifische Konzentration. Volle Symbole: Standardkultivierungen, offene Symbole: Kontrollkultivierungen. 4.2.4 Von σ32 (rpoH) kontrollierte Hitzeschockantwort 4.2.4.1 Induktionsverhältnisse von Hitzeschockproteinen Die Induktionsverhältnisse einiger Hitzeschockproteine (Bildungsgeschwindigkeiten bezogen auf die jeweiligen Bildungsgeschwindigkeiten vor dem Temperatursprung) sind in Abb. 22 gezeigt. Schon in der ersten Probe (1 min nach dem Temperatursprung) wurden erhöhte Bildungsgeschwindigkeiten der Hitzeschockproteine gefunden. Das Maximum wurde in der Kontrollkultivierung nach fünf Minuten erreicht. Nach einer Stunde waren die Bildungsgeschwindigkeiten schon wieder sehr stark zurückgegangen61. Die Kinetik der Hitzeschockantwort mit TG1 pCytexP1 im Fed-Batch (Abb. 22 oben) entspricht damit der von nicht-rekombinanten E. coli in Schüttelkolben (Lemaux et al., 1978).

61

Abweichend von den Angaben in der Literatur (Lemaux et al. (1978), wo nur für eine Stunde nach dem Temperatursprung gemessen worden war), aber in Übereinstimmung mit Daten betreffend die mRNA-Syntheseraten (M. Hecker) erreichten die Bildungsgeschwindigkeiten keinen neuen stationären Wert, sondern gingen spätestens nach drei Stunden wieder vollständig auf das Niveau bei 30°C zurück.

80

4. Ergebnisse und Diskussion

120 100 80

Induktionsverhältnis

60 40 20 0 0

1

2

3

4

5

0

1

2

3

4

5

120 100 80 60 40 20 0

tind /h Abb. 22: Induktionsverhältnisse von Hitzeschockproteinen Bildungsgeschwindigkeiten bezogen auf die Bildungsgeschwindigkeiten vor dem Temperatursprung. Oben: Kontrollkultivierung, unten: Standardkultivierung. Symbole: DnaK (Quadrat), GroEL (Kreis), ClpB (Dreieck nach oben), ClpB‘ (Dreieck nach unten), HtpG (Raute). Mikroorganismen werden in Schüttelkolbenexperimenten auf ihre Eignung, eine gegebene Aufgabe zu bewältigen, getestet. Beim Übergang zu technischen Produktionsbedingungen verändern sich mit den Prozeßvariablen auch einige Eigenschaften der Mikroorganismen, die u. U. dazu führen, daß das angestrebte Ziel nicht erreicht wird62. Im Zuge der Maßstabsvergrößerung muß also geprüft werden, welche für den physiologischen Zustand des Organismus wichtigen Parameter sich verändern. Die Kinetik der Hitzeschockantwort wurde durch die 62

Beispielsweise produzierte TG1 pJHL, der das bFGF-Gen unter der Kontrolle des IPTG-induzierbaren Promotors tac trägt, im Schüttelkolben bei 30°C bis zu 60 mg g-1 an ausschließlich löslichem bFGF. In Hochzelldichtekultivierungen war das Plasmid so instabil, daß bei Induktion die Kultur in der Regel von plasmidfreien Zellen überwachsen war (nicht dargestellte Ergebnisse).

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

81

speziellen Bedingungen des technischen Prozesses (geringe Wachstumsrate, Glukoselimitierung, hohe Zelldichte von 50 g L-1) nicht beeinflußt.

80

Anteil /%

60

40

20

0 0

2

4

6

8

tind /h

Abb. 23: Anteil der Hitzeschockproteine an der Gesamtproteinsynthese Bildungsgeschwindigkeiten von DnaK, GroEL, GroES, HtpG, ClpB, ClpB', DnaJ und GrpE bezogen auf die Summe der Bildungsgeschwindigkeiten aller Proteine; geschlossene Symbole: Standardkultivierung, offene Symbole: Kontrollkultivierung. In der Standardkultivierung war die Hitzeschockantwort langsamer als in der Kontrollkultivierung. Die Bildungsgeschwindigkeiten durchliefen ein Maximum nach 30 – 60 min (Abb. 22 unten). Allerdings wurden auch fünf Stunden nach dem Temperatursprung noch hohe Bildungsgeschwindigkeiten der Hitzeschockproteine gefunden. Der Rückgang der Bildungsgeschwindigkeiten wird durch die Verringerung der Translationskapazität verursacht. Der Anteil der Hitzeschockproteine an der gesamten Proteinsynthese betrug maximal 60 – 70% und blieb in der Standardkultivierung bis zum Kultivierungsende um 40% (Abb. 23)63. Die Bildungsgeschwindigkeiten der Hitzeschockproteine (Abb. 22) nahmen in der Standardkultivierung noch weiter zu, während die Anteile an der Gesamtproteinsynthese (Abb. 23) schon stagnierten, weil die relative Gesamttranslation (vgl. Abb. 15 auf S. 67) bis 30 min nach dem Temperatursprung anstieg.

63

Bei Berücksichtigung des Methioningehalts der identifizierten Proteine steigt der Anteil der rpoH-abhängigen Hitzeschockproteine in der Standardkultivierung im Maximum auf 50% und geht danach auf 30% zurück.

82

4. Ergebnisse und Diskussion

4.2.4.2 Kinetik der Hitzeschockantwort Die Hitzeschockantwort läßt sich in drei Phasen unterteilen: Induktion, Maximum und Abklingen. Standard- und Kontrollkultivierung werden hinsichtlich dieser Phasen verglichen. Induktionsphase Rekombinante Proteine können, wie „abnormale“ Proteine64 , die Hitzeschockantwort in E. coli auslösen (Goff und Goldberg, 1985). Je mehr die Faltung, z. B. durch Mutationen, gestört ist, desto stärker ist die induzierte Hitzeschockantwort (Parsell und Sauer, 1989). Proteolytisch instabile Proteine rufen die Hitzeschockantwort erst hervor, wenn sie durch C- oder N-terminale Fusionen stabilisiert werden (Snow und Hipkiss, 1987); die Induktion beruht also auf der Konzentration der Proteine, nicht auf ihrem Abbau (Parsell und Sauer, 1989). Die durch rekombinante Proteine bei 30°C induzierte Hitzeschockantwort setzt später ein als die Temperatur-induzierte (vgl. Lemaux et al. (1978) mit Parsell und Sauer, 1989). Das rührt daher, daß rekombinante Proteine den Sigma-Faktor σ32 nur stabilisieren, nicht aber seine Synthese anregen (Kanemori et al., 1994). Die zitierten Untersuchungen wurden bei „niedrigen“ Temperaturen durchgeführt. Bei einem Temperatursprung hat die Synthese eines rekombinanten Proteins mit kleiner Bildungsgeschwindigkeit keinen Einfluß auf die Induktionsphase der Hitzeschockantwort (Tomoyasu et al., 1998). Durch die starke Produktion von bFGF wird der Anstieg der Bildungsgeschwindigkeiten von Hitzeschockproteinen verzögert: das Maximum der Bildungsgeschwindigkeiten wird 30 – 60 min nach dem Temperatursprung durchlaufen, während es in der Kontrollkultivierung schon nach 5 min erreicht war. Die ist nicht vergleichbar mit der langsameren Induktion der Hitzeschockantwort durch rekombinante Proteine bei niedriger Temperatur, denn hier wird die Hitzeschockantwort ja sowohl durch die Temperatur als auch durch denaturiertes bFGF induziert. Vielmehr handelt es sich um eine Konkurrenz zwischen den mRNAs von bFGF und Hitzeschockproteinen um die limitierende Translationskapazität. Die Transkription des bFGFGens vom starken λPRPL-Promotortandem aus und die hochaffine Ribosomen-Bindungsstelle der mRNA verschaffen der bFGF-mRNA einen Vorteil bei dieser Konkurrenz. Die bFGFBildung schädigt die Wirtszelle, indem sie die Synthese der bei hohen Temperaturen dringend benötigten Hitzeschockproteine verzögert.

64

Proteine, die aufgrund von Mutationen oder wegen des Einbaus von Aminosäure-Analogen oder vorzeitigen Abbruchs der Translation keine stabile „native“ Konformation einnehmen können.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

83

Das bFGF-Protein seinerseits ist zur Aufrechterhaltung seiner nativen Konformation auf Chaperone angewiesen. In den ersten dreißig Minuten nach Induktion – also solange die Hitzeschockproteine mit submaximaler Bildungsgeschwindigkeit synthetisiert werden – akkumulierte bFGF ausschließlich in unlöslicher Form. Dies ist das direkteste Beispiel für eine Wechselwirkung zwischen physiologischem Zustand des Wirtsorganismus und der Produktqualität des rekombinanten Proteins: die hohe Bildungsgeschwindigkeit von bFGF verhindert die angemessene Synthese zelleigener Proteine, und die unzureichende Konzentration an freiem DnaK (und möglicherweise anderer Chaperone) führt zur Aggregation von bFGF. Maximalphase Die Konzentration an freiem DnaK ist autoreguliert: die Transkription der Hitzeschock-Gene hält solange an, bis genügend Transkripte vorhanden sind, um erfolgreich um die Translationskapazität zu konkurrieren. Die Stärke der Hitzeschockantwort (also das Induktionsverhältnis im Maximum) war für Standard- und Kontrollkultivierung gleich. Für ClpB und ClpB‘ (zwei Produkte der gleichen mRNA mit unterschiedlichem Translationsstartpunkt, Park et al., 1993) betrug das maximale Induktionsverhältnis 100x, für HtpG 40x, für GroES 35x, für DnaK 30x, für GrpE65 7x und für DnaJ 4x in allen Kultivierungen. Für GroEL war es 20x in der Standardkultivierung, hier allerdings nur 10x für die Kontrollkultivierung66. Die einzelnen Zahlenwerte sind nicht mit Literaturangaben zu vergleichen, da Faktoren wie die Medienzusammensetzung die Konzentrationen der Hitzeschockproteine beeinflussen (Heitzer et al., 1992). In Schüttelkolbenexperimenten (Neidhardt und VanBogelen, 1987) oder bei der Überexpression des Gens rpoH für den Sigma-Faktor σ32 bei 30°C (VanBogelen et al., 1987a) werden verschiedene Induktionsverhältnisse gefunden. Ferner werden, wenn andere Stimuli als ein Temperatursprung die Hitzeschockantwort auslöst, nur Teilmengen der Hitzeschockproteine induziert (VanBogelen et al., 1987b). Es kann also auch bei ausgelöster Hitzeschockantwort eine Feinregulation die Induktionsverhältnisse der einzelnen Hitzeschockproteine verändern, und diese Feinregulation könnte im Fed-Batch anders ausfallen als in Satzkultivierung67. Unter gegebenen Bedingungen (hier also Fed-Batch) werden die rpoH-

65

GrpE und DnaJ wurden über ihre Position auf dem 2D-Gel, nicht durch Sequenzierung, identifiziert. Die Bildungsgeschwindigkeiten von GroEL sind vor dem Temperatursprung in Standard- und Kontrollkultivierung gleich. Anders als für die anderen hier beschriebenen Hitzeschockproteine ist die Induktion von GroEL in der Standardkultivierung nicht gegenüber der Kontrollkultivierung verzögert. Möglicherweise unterliegt groELS einer Feinregulation wie in 4.2.5 für ibpAB beschrieben. 67 Allerdings liegen manche Hitzeschockproteine auf 2D-Gelen in der Nähe von Proteinen des Proteinproduzierenden Systems, die in Satzkultivierung mit hohen Bildungsgeschwindigkeiten produziert werden und die Basallevel der Hitzeschockproteine maskieren könnten. Insbesondere liegen EF-G und ClpB übereinander, was das in der Literatur berichtete deutlich kleinere Induktionsverhältnis von 10x (Neidhardt und VanBogelen, 1987) erklären könnte. 66

84

4. Ergebnisse und Diskussion

abhängigen Hitzeschockproteine in Standard- und Kontrollkultivierung mit den gleichen Induktionsverhältnissen induziert. Sie scheinen also en bloc reguliert zu werden, und die Akkumulation von bFGF greift in diese Feinabstimmung nicht ein. Temperatur-denaturierte zelluläre Proteine und ungefaltetes bFGF agieren also über denselben Sensor. Abklingphase In der Kontrollkultivierung war die Anpassung an die höhere Temperatur nach einer Stunde nahezu abgeschlossen; die Bildungsgeschwindigkeiten gingen danach auf das Vorinduktionsniveau zurück. In der Standardkultivierung blieb der Anteil der Hitzeschockproteine an der gesamten Proteinsynthese bis zum Ende der Kultivierung hoch (Abb. 23). Die bFGF-Bildung verhindert das Abklingen der Hitzeschockantwort. Da die maximalen Induktionsverhältnisse für Standard- und Kontrollkultivierung gleich sind, ist also die Hitzeschockantwort bei Produktion des rekombinanten Proteins gleichzeitig zum Temperatursprung nicht stärker, sondern bleibt nur länger induziert. Erst kürzlich zeigten Tomoyasu et al. (1998), daß die Synthese eines rekombinanten Proteins schon bei nur 1500 Molekülen pro Zelle das Abklingen der Temperatur-induzierten Hitzeschockantwort verzögert. Da die Hitzeschockantwort über die Konzentration an freiem DnaK autoreguliert ist, zeigt dies einen bleibenden Mangel an DnaK ab. Einige Besonderheiten bFGF-produzierender Zellen können wahrscheinlich darauf zurückgeführt werden. Viele zelluläre Prozesse werden durch Proteine vermittelt, die auf DnaK angewiesen sind, z. B. DNA-Replikation (Foster und Marinus, 1992; Wyman et al., 1993) und Chromosomensegregation (Bukau und Walker, 1989). Die Vergrößerung der Zellen nach der Induktion von bFGF könnte auf dem Ausbleiben der DNA-Replikation und der Zellteilung beruhen. Auch die ausbleibende Anpassung des Plasmidmassenanteils (s. 4.2.3.1) an die verringerte Wachstumsrate in der Standardkultivierung kann durch den DnaK-Mangel verursacht sein. 4.2.4.3 Stärke der Hitzeschockantwort Die Translationsaktivität nahm sowohl in Standard- als auch Kontrollkultivierung nach dem Temperatursprung stark zu (s. 4.2.1). Den größten Anteil an der Zunahme hatten die Hitzeschockproteine. Die Bildungsgeschwindigkeiten in der Standardkultivierung wiesen etwa die gleichen Maximalwerte auf wie in der Kontrollkultivierung (Abb. 22 auf S. 80), gingen aber selbst nach Stunden kaum zurück und machten am Kultivierungsende etwa 40% der gesamten Proteinsynthese aus (Abb. 23). Der Anteil der Hitzeschockprotein-Bildungsgeschwindigkeiten an der Gesamtproteinsynthese 15 min nach dem Temperatursprung summiert sich auf etwa 55% (Tabelle 17), während die

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

85

Hitzeschockproteine bei 30°C nur mit etwa 7,5% zur Gesamtproteinsynthese beitrugen. Zieht man in Betracht, daß bFGF und ein bFGF-Fragment weitere 30% bzw. bis zu 8% ausmachten, blieben trotz der zeitweilig auf 250% des Vorinduktionsniveaus gestiegenen Translationskapazität weniger als 20% der in der Fed-Batch-Phase I für Haushaltsproteine verfügbaren Kapazität übrig. Dies ähnelt dem Expressionsmuster von Zellen, die einem letalen Hitzeschock ausgesetzt sind und wegen der anhaltend hohen Bildungsgeschwindigkeiten von Hitzeschockproteinen nicht zu einem ungestreßten Zustand zurückfinden können. In der Standardkultivierung muß neben der bFGF-Synthese selbst das verhinderte Abklingen der Hitzeschockantwort, das durch die Aggregationsneigung von bFGF verursacht wird, als eine Hauptursache für die kleine Wachstumsrate und ggf. den Verlust der Vitalität der Zellen angesehen werden. Tabelle 17: Anteile der Hitzeschockproteine an der Gesamtproteinsynthese 15 min nach dem Temperatursprung* Protein ClpB ClpB‘ c DnaK GroEL GroES HtpG DnaJ? b GrpE? b Summe

vor Temperatursprung Maximumd 0,3 7 0,15 2 1,5 15 3,6 20 a 0,3 3 0,25 2 1 2 0,3 3 7,5 54

*)

Zu diesem Zeitpunkt waren die Anteile in Standard- und Kontrollkultivierung etwa gleich (vgl. Abb. 23). Angaben in Prozent. a) In der Kontrollkultivierung nur 10% b) Über die Position auf dem Gel, nicht durch N-terminale Sequenzierung identifiziert c) Zweites Translationsprodukt der gleichen mRNA, ab Aminosäure 149 (Park et al., 1993) d) Beim Vergleich mit dem Induktionsverhältnis in Abb. 22 muß berücksichtigt werden, daß sich die Gesamttranslation nach dem Temperatursprung erhöhte (15 min nach dem Temperatursprung betrug die relative Gesamttranslation etwa 200%, vgl. Abb. 15). Oft wird die Auswirkung der Produktion eines rekombinanten Proteins auf den physiologischen Zustand des Wirtsorganismus durch die „Stoffwechsellast“, also als Bausteine und Energie zur Synthese des rekombinanten Proteins, beschrieben. Diese Interpretation greift im Falle instabiler Proteine, die auf Chaperone angewiesen sind, zu kurz. Durch die Induktion bzw. die Verhinderung des Abklingens der Hitzeschockantwort werden noch einmal soviel Ressourcen wie durch die Herstellung des rekombinanten Proteins selbst für die Bereitstellung der Hitzeschockproteine in Anspruch genommen. Das rekombinante Protein und die Hitzeschockproteine schließen andere zelleigene Proteine fast vollständig von der Synthese aus,

86

4. Ergebnisse und Diskussion

obwohl bei höherer Temperatur die Proteinsynthesekapazität durch die erhöhte PeptidVerlängerungsrate gesteigert ist. Da Proteinsynthese der energieaufwendigste Prozeß in der Zelle ist, muß ein großer Anteil der (ohnehin limitierenden) Kohlenstoffquelle zur Energiegewinnung veratmet werden (s. 4.2.8 und 4.3.3.4). Zur Hitzeschockantwort gehörende Proteasen vermindern die Akkumulation des rekombinanten Proteins; da sie ATP benötigen sind, verbrauchen sie weitere Ressourcen. Darüber hinaus hat der Mangel an DnaK pleiotrope Effekte auf den Wirtsorganismus. Einer dieser Auswirkungen ist die Aggregation von bFGF (und anderen Proteinen, z. B. der in E. coli TG1 konstitutiv synthetisierten Tagatose-Biphosphat-Aldolase GatY; Rinas, 1998). Proteinaggregate können die Innere Membran schädigen: In rpoH-Mutanten, in denen nach einem Temperatursprung Aggregate stabil akkumulieren, sind diese Schädigungen letal für die Zellen (Kucharczyk et al., 1991). Viele Effekte, die in den hier oder in der Literatur beschriebenen Kultivierungen mit Produktion rekombinanter Protein auftreten, nämlich Schäden an der Membran, Abbau von Ribosomen und rRNA (Dong et al., 1995) und die nahezu ausschließliche Synthese von Hitzeschockproteinen, werden auch bei einem Temperatursprung auf die letale Temperatur von 50°C beobachtet (Neidhardt und VanBogelen, 1987). Möglicherweise sind sie alle Kennzeichen unzureichender Hitzeschockprotein-Konzentrationen. Die schädigende Wirkung von bFGF auf den Wirtsorganismus E. coli beruht nicht nur auf der bloßen Synthese des rekombinanten Proteins. Die langsame Faltung bzw. die geringe Stabilität gegen Denaturierung bei hoher Temperatur bringt verstärkte Neigung zur Aggregation mit sich. Deshalb titriert bFGF Chaperone, wodurch die davon abhängigen zellulären Prozesse inhibiert werden. 4.2.4.4 Konzentrationen von DnaK, dem Regulator der Hitzeschockantwort Im Fed-Batch stieg die Konzentration von DnaK in TG1 pCytexP1 auf das dreifache, in TG1 pλFGFB gleichzeitig zur bFGF-Produktion sogar auf das Fünffache der in der Fed-BatchPhase I gemessenen Konzentration (Abb. 24). Die Akkumulationsgeschwindigkeit war dabei zunächst für Standard- und Kontrollkultivierung ähnlich. Obwohl in der Standardkultivierung der Bedarf an Hitzeschockproteinen wegen der bFGF-Bildung deutlich höher lag als in der Kontrollkultivierung, konnten die Hitzeschockproteine nicht schneller bereitgestellt werden. Da Zellen mit unzureichender Hitzeschockprotein-Konzentration leicht geschädigt werden können, kann man annehmen, daß die Hitzeschockantwort in der Evolution auf eine möglichst kurze Reaktionszeit hin optimiert wurde. Die Anpassung auf die Produktion eines instabil gefalteten Fremdproteins kann nicht über eine Beschleunigung, sondern nur über eine Verlängerung der Hitzeschockantwort erfolgen. Dementsprechend akkumulierte DnaK in der Stan-

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

87

dardkultivierung länger, schließlich auch zu einer deutlich höheren Konzentration als in der Kontrollkultivierung. Wie die bFGF-Konzentration erreichte die Konzentration von DnaK nach vier Stunden ein stationäres Niveau. Synthese und Degradation von bFGF erreichen ein Gleichgewicht, und die akkumulierte Menge an Hitzeschockproteinen reicht aus, die akkumulierte Menge an bFGF zu stabilisieren68.

spez. Konzentration /mg g

-1

35 30 25 20 15 10 5 0 0

2

4

6

8

tind /h

Abb. 24: Spezifische Konzentrationen des Hitzeschockproteins DnaK nach dem Temperatursprung aus Coomassie-gefärbten 2D-Gelen. Geschlossene Symbole: Standardkultivierungen; offene Symbole: Kontrollkultivierung; Trendlinien. Die tatsächlichen Konzentrationen der Hitzeschockproteine (Abb. 24) stiegen deutlich langsamer als der durch das rekombinante Protein verursachte Bedarf. Die Bildungsgeschwindigkeit der Hitzeschockproteine in der Standardkultivierung wird dabei wahrscheinlich noch überschätzt69. Die Bildungsgeschwindigkeiten über der Zeit integriert lag deutlich höher als

68

Es ist nicht auszuschließen, daß der Rückgang der Proteinsynthese als solche die weitere Akkumulation von bFGF und Hitzeschockproteinen verhindert. 69 Mit dem für die Nicht-Gleichgewichts-pH-Elektrophorese zu verwendenden chaotropen Reagenz Harnstoff werden Membranproteine und aggregiertes bFGF unvollständig solubilisiert und nicht auf den 2D-Gelen nachgewiesen. Da über die Gesamtmenge markierten Proteins normiert wird, resultieren kleinere bFGFBildungsgeschwindigkeiten in höheren Meßwerten für die übrigen Proteine. Aus eindimensionalen SDS-Gelen abgeschätzte Bildungsgeschwindigkeiten der Hitzeschockproteine liegen anfangs (tind < 30 min) höher, ab einer Stunde nach dem Temperatursprung um etwa ein Drittel niedriger als die aus den 2D-Gelen erhaltenen. Die aus 1D-SDS-Gelen bestimmte bFGF-Bildungsgeschwindigkeit ist besonders unmittelbar nach Induktion deutlich höher als die mit 2D-Gelen gemessene; sie beträgt im Maximum 70 mg g-1 h-1.

88

4. Ergebnisse und Diskussion

die gemessenen Konzentrationen der Hitzeschockproteine DnaK, GroEL oder ClpB. In der Kontrollkultivierung stimmten die beiden Verläufe für Hitzeschockproteine überein. Für Haushaltsproteine deckten sich gemessene Konzentrationen und integrierte Bildungsgeschwindigkeiten in beiden Kultivierungen (nicht gezeigt). Degradation oder Verlust ins Medium können diesen Unterschied nicht erklären70. In Schüttelkolbenexperimenten steigen die Konzentrationen der Hitzeschockproteine „nur“ auf das doppelte (Bukau, 1993). Hitzeschockproteine werden auch unter Hungerbedingungen induziert (Hengge-Aronis, 1996). Es kann nicht unterschieden werden, ob hier andere als direkte Temperatureffekte, z. B. die in der Fed-Batch-Phase II ausgeprägtere Glukoselimitierung, zur Akkumulation der Hitzeschockproteine beitragen, oder ob z. B. die unterschiedliche Zusammensetzung der verwendeten Medien eine Rolle spielt (Heitzer et al., 1992). 4.2.5 Nicht von σ32 (rpoH) kontrollierte Hitzeschockproteine 4.2.5.1 Kinetik der Bildung kleiner Hitzeschockproteine Die kleinen Hitzeschockproteine (sHsp) IbpA und IbpB (Molekulargewicht etwa 16 kDa, Position auf 2D-Gelen bei 14,8 kDa) bilden in zweierlei Hinsicht eine Ausnahme von den oben beschriebenen Hitzeschockproteinen. Erstens: Während die anderen Hitzeschockproteine zum weitaus größten Teil löslich sind, werden die inclusion body Proteine A und B in der unlöslichen Zellfraktion gefunden (Abb. 25). Dort blieben sie permanent: im Pulse-ChaseExperiment war auch nach 90 min keine Verringerung der IbpAB-Konzentration in der unlöslichen Zellfraktion festzustellen (nicht gezeigt). Auch in plasmidfreien E. coli liegt IbpB nach einem Hitzeschock in der unlöslichen „S-Fraktion“ vor (Laskowska et al., 1996). Zweitens: Die Bildungsgeschwindigkeiten der sHsp zeigten sowohl in der Standard- als auch in der Kontrollkultivierung ein ausgeprägtes Maximum etwa 5 min nach dem Temperatursprung, danach fielen sie auch in der Standardkultivierung innerhalb einer Stunde auf das Vorinduktionsniveau (Abb. 26). Die sHsp werden nicht – oder zumindest im viel geringerem Ausmaß als rpoH-abhängige Hitzeschockproteine – durch bFGF induziert71. 70

In Pulse-Chase-Experimenten konnte weder mit Reaktorproben noch im Schüttelkolben nennenswerte Degradation der Hitzeschockproteine festgestellt werden. Sie wird auch in der Literatur nicht beschrieben. (In Spirocheten wird DnaK nach einem Rücktransfer auf 30°C abgebaut (Cluss et al., 1996); die Verhältnisse hier sind dem aber nicht vergleichbar.) DnaK kann durch einen osmotischen Schock freigesetzt werden (el Yaagoubi et al., 1994). Es wird nach dem Temperatursprung im zellfreien Kulturüberstand gefunden (Rinas, 1998). Die nachgewiesenen Mengen an DnaK erklären den Überschuß der aufsummierten Bildungsgeschwindigkeit über die akkumulierte Menge nicht. Auch für andere Hitzeschockproteine, die nicht in den Kulturüberstand gelangen, wie GroEL oder ClpB, übersteigt das Integral der Bildungsgeschwindigkeit die gemessenen Konzentrationen. 71 Die Abwesenheit der Expression von ibpB 20 min nach Induktion von bFGF in Batch-Experimenten wurde im Prinzip schon von Rinas (1996) gefunden; dort wurden aber GroES und IbpB – die auf den 2D-Gelen sehr nahe beieinander liegen – vertauscht. Durch Gele, auf denen beide Proteine gleichzeitig vorhanden sind, wurde eine korrekte Zuordnung möglich.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

89

Abb. 25: Verteilung radioaktiv markierter Proteine auf die Zellfraktionen Autoradiogramme von SDS-Gelen; G…Gesamtzellprotein, L…lösliche, U… unlösliche Zellfraktion (jeweils gleiche Kulturvolumina; U vierfach konzentriert). Proben aus Standardkultivierung zu den angegebenen Zeiten nach dem Temperatursprung markiert. Positionen von Hitzeschockproteinen und von bFGF, Molekulargewicht in kDa.

-1

Bildungsgeschwindigkeit /mg g h

-1

10

5

0 0

1

2

3

4

5

tind /h

Abb. 26: Bildungsgeschwindigkeit der Hitzeschockproteine IbpA und IbpB Dreiecke: IbpA, Kreise: IbpB; geschlossene Symbole: Standardkultivierung, offene Symbole: Kontrollkultivierung.

90

4. Ergebnisse und Diskussion

Im Gegensatz zu den Beobachtungen mit bFGF werden bei der Überproduktion anderer humaner Proteine in E. coli IbpA und IbpB induziert (Allen et al., 1992). Bei der Produktion dieser Proteine macht IbpB einen sehr hohen Anteil der Proteine in den Einschlußkörpern aus (Allen et al., 1992). Dies ist auch bei der Herstellung einiger viraler Proteine, die ausschließlich in Einschlußkörpern anfallen, in E. coli BL21 der Fall (X. Carbonell et al., persönliche Mitteilung). In cytoplasmatischen Einschlußkörpern von β-Laktamase72 wurden IbpA und IbpB nicht gefunden (Valax und Georgiou, 1993). 4.2.5.2 Anhaltspunkte zum Verständnis der Regulation In E. coli BL21 pλFGFB, in dem die Protease Lon - im Wildtyp für den größten Teil der ATP-abhängigen Proteindegradation verantwortlich – eliminiert ist, akkumulierte bFGF vier Stunden nach Induktion im Schüttelkolben zu höheren Konzentrationen als in TG1 pλFGFB. Dabei war die Konzentration von bFGF in der löslichen Fraktion vom BL21 pλFGFB gegenüber der Konzentration in TG1 pλFGFB um die Hälfte reduziert; bFGF akkumulierte hauptsächlich in Einschlußkörpern. Unter diesen Bedingungen akkumulierte IbpB ebenfalls in den Einschlußkörpern (Tabelle 18). Die Konzentration ist deutlich geringer als die des rekombinanten Proteins bFGF. Möglicherweise wechselwirkt bFGF nicht direkt mit IbpAB, und die Induktion wird durch zelleigene Proteine hervorgerufen, denen durch bFGF die ATPabhängigen Chaperone entzogen werden. Die Konzentration des rpoH-abhängigen Hitzeschockproteins GroES in der löslichen Zellfraktion wurde nicht beeinflußt. Tabelle 18: Akkumulation von bFGF, GroES und IbpB in zwei Stämmen von E. coli Konzentrationsangaben in mg g-1, Proben vier Stunden nach Induktion (Schüttelkolben) Protein Zellfraktion TG1 pλFGFB BL21 pλFGFB

bFGF gesamt 90 120

bFGF löslich 56 28

GroES löslich 25 25

IbpB unlöslich 8

Die kleinen Hitzeschockproteine dienen als „erste Abwehrkette“ (Buchner, 1996): solange nicht genügend ATP-abhängige Chaperone und Proteasen für die Behandlung denaturierter Proteine gebildet sind, binden die sHsp stabil an nicht-native Proteine, um ihre irreversible Denaturierung zu verhindern (Buchner, 1996; Veinger et al., 1998). Genauso könnten IbpA und IbpB demnach eine „Reserve“ der Zellen darstellen, die aktiviert wird, wenn die „normale“ Hitzeschockantwort nicht ausreicht, mit ungefalteten Proteinen umzugehen (d. h. sie entweder zu falten oder abzubauen). Weil E. coli TG1 offensichtlich einen Weg finden, die

Die Signalsequenz der β-Laktamase wurde eliminiert, wodurch die β-Laktamase im Cytoplasma akkumulierte. Etwa 20% der gebildeten β-Laktamase lag in Einschlußkörpern vor (Valax und Georgiou, 1993). 72

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

91

Akkumulation unlöslichen bFGFs ab etwa 30 min nach Induktion zu verringern, wird die IbpAB-Reserve nicht benötigt, während sie im Falle weitgehend oder ausschließlich aggregierender rekombinanter Proteine aktiviert ist. Es stellt sich die Frage nach dem Signal, das die Reserve mobilisiert. Es wurde oft angenommen, daß das Operon ibpAB unter der Kontrolle des Sigma-Faktors σ32 steht (z. B. Gross, 1996; Thomas und Baneyx, 1998). Dies liegt an der nahezu perfekten Übereinstimmung des Promotors von ibpAB mit der Hitzeschock-Konsensussequenz (vgl. Chuang et al. (1993) mit Neidhardt und VanBogelen, 1987). Bei Überproduktion des Sigma-Faktors σ32 bei 30°C werden aber von den 17 damals bekannten Hitzeschockproteinen nur 14 verstärkt hergestellt; die Ausnahme bilden (neben LysU) IbpA und IbpB (in VanBogelen et al. (1987a) mit C14.7 und G13.5 bezeichnet). Andererseits werden IbpA und IbpB auch in rpoH-Mutanten (die kein σ32 produzieren) durch einen Temperatursprung induziert (Laskowska et al., 1996). Der SigmaFaktor σ32 ist also weder notwendig noch hinreichend für die Expression von ibpAB. In rpoH-Mutanten sind bei 30°C die Konzentrationen an IbpA und IbpB höher als in WildtypZellen; bei Überproduktion von σ32 werden nach einem folgenden Temperatursprung weniger IbpA und IbpB gebildet (Laskowska et al., 1996). Dies unterstützt die Auffassung, daß die ibpAB-Induktion negativ mit der Chaperon-Verfügbarkeit korreliert ist. Verschiedene Streßfaktoren (Hitze, H2O2, UV-Strahlung) induzieren verschiedene Streßantworten. IbpA und IbpB werden z. B. durch Puromycin (neben GrpE, GroES, HtpK und ClpP) und Cadmiumchlorid (neben GrpE, DnaK, HtpG und ClpB), nicht dagegen durch Nalidixinsäure (das GrpE, GroEL, GroES, DnaK, HtpH, LysU, HslV und ClpB induziert) induziert (VanBogelen et al., 1987a). Durch Cadmiumchlorid wird IbpB stärker induziert als HtpG, obwohl das Induktionsverhältnis bei Hitze gleich ist (VanBogelen et al., 1987b). In Reaktion auf ähnliche Streßfaktoren werden einzelne Hitzeschock-Operons differenziert induzieren. Über den Mechanismus kann man nur Vermutungen anstellen: Eine andere Streßantwort, die von σ38 kontrollierte Hungerantwort, wird durch eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren modifiziert. Ein wichtiger Regulator ist das Protein Lrp. Es ist plausibel anzunehmen, daß auch die Hitzeschockantwort differenziert reguliert werden kann und daß ähnliche Mechanismen wie in anderen Streßantworten benutzt werden. Indirekte Hinweise sprechen für eine Rolle von Lrp bei der Regulation von ibpAB73.

73

Mutanten in metK sind kaum lebensfähig, sie sammeln lrp-Mutationen an (Referenz 61 in Newman et al., 1996). Matthews und Neidhardt (1988) finden, daß ibpAB nach einem Hitzeschock in metK-Mutanten nicht induziert werden, während andere Hitzeschockproteine normal induziert werden und lysU konstitutiv synthetisiert wird. Lrp (Leucin-Repressor-Protein) reguliert eine Vielzahl von Operons. Beispielsweise wird lysU durch Lrp reprimiert, andere Operons werden durch Lrp aktiviert (Newman et al., 1996).

92

4. Ergebnisse und Diskussion

Die Produktion von bFGF verhinderte das Abklingen der Hitzeschockantwort in Standardkultivierungen. Da die Konzentration an freiem DnaK autoreguliert ist, zeigt dies einen bleibenden Mangel an freiem DnaK an. Trotzdem fand TG1 einen Weg, mit zu Aggregation neigendem bFGF umzugehen, denn ab 30 min nach dem Temperatursprung akkumulierte deutlich weniger unlösliches bFGF. Vermutlich wurde überschüssiges bFGF abgebaut. Anders als ATP-abhängige Chaperone wurden die kleinen Hitzeschockproteine IbpA und IbpB in der Standardkultivierung nicht dauerhaft induziert; ihre Bildungsgeschwindigkeiten zeigten vielmehr eine ähnliche Kinetik wie in der Kontrollkultivierung. In E. coli BL21 pλFGFB war die Degradation von bFGF stark reduziert, wodurch mehr bFGF akkumuliert. Verringerte Degradation führte allerdings zu verstärkter Aggregation; die Konzentration an löslichem bFGF war in BL21 kleiner als in TG1. Unter diesen Bedingungen akkumulierte IbpB in den Einschlußkörpern. Es wird daraus geschlossen, daß die Bildungsgeschwindigkeiten der kleinen Hitzeschockproteine IbpA und IbpB negativ mit der Chaperon-Verfügbarkeit korreliert sind. Bisher konzentriert sich die Literatur zur Regulation der Hitzeschockantwort fast ausschließlich auf die Kontrolle über den Sigma-Faktor σ32. Die hier vorgestellten Ergebnisse lassen dagegen vermuten, daß die Hitzeschockantwort vielschichtiger reguliert ist, möglicherweise ähnlich komplex wie die Hungerantwort, bei der eine große Anzahl von Transkriptionsfaktoren ineinander verflochtene Regulationsmuster bedingen (Hengge-Aronis, 1996). 4.2.6 Periplasmatische Proteine Wie für Proteine des Protein-produzierenden Systems (Abb. 16) und allgemein für Haushaltsproteine (Abb. 14) gezeigt, konnten auch die periplasmatischen Bindungsproteine nicht mehr mit der in der Fed-Batch-Phase I gefundenen Geschwindigkeit gebildet werden. Exemplarisch ist dies für das Dipeptid-Bindungsprotein (DppA), das in der Fed-Batch-Phase I das mit Abstand häufigste Protein in der Zelle war, in Abb. 27 gezeigt. Auch hier überlagern sich zwei Ereignisse: ein langsamer Trend, der eine Anpassung an die verringerte Wachstumsrate darstellt, und ein schneller vorübergehender Rückgang der Bildungsgeschwindigkeiten. Letzerer wird wie oben diskutiert auf die Verdrängung des Haushalts-Sigmafaktors σ70 durch den Hitzeschock-Sigmafaktor σ32 zurückgeführt. Für periplasmatische Proteine, die schon in der Fed-Batch-Phase I jeweils nur weniger als 2% der Gesamtproteinsynthese ausmachten wie die Bindungsproteine für Arginin (ArgT), verzweigte Aminosäuren (LivJ) oder Galaktose (MglB), war in der Standardkultivierung nach dem Temperatursprung keine Produktion mehr festzustellen (nicht gezeigt). Auch in der Kontrollkultivierung fielen die Bildungsgeschwindigkeiten z. T. bis an die Nachweisgrenze.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

93

-1

Bildungsgeschwindigkeit /mg g h

-1

25

20

15

10

5

0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

tind /h

Abb. 27: Bildungsgeschwindigkeit des periplasmatischen Dipeptid-Bindungsproteins DppA nach dem Temperatursprung auf 42°C Geschlossene Symbole: Standardkultivierung, offene Symbole: Kontrollkultivierung. Diese Proteine sind Teil des jeweiligen BPD-ABC-Transporter-Systems74 (Boos und Lucht, 1996). Das Bindungsprotein stellt die hochaffine Substraterkennungsstelle dar. Es liegt relativ zu den Membrankomponenten in großem Überschuß vor. Bei diesen Proteinen kann der schnelle Rückgang der Bildungsgeschwindigkeit auf der Instabilität der mRNA unter Hitzeschockbedingungen beruhen75. Daneben greift für periplasmatische Proteine eine globale Regulation, die die Translation inhibiert, wenn der Export beeinträchtigt ist (Oliver, 1996).

74

Diese benötigen ein Bindungsprotein für die aufzunehmende Substanz (binding protein dependent), und sind ATP-getriebene Primärpumpen (ATP-binding casette in der membrangebundenen Komponente des Systems). Damit sind sie der dritte Typ von Transportsystemen neben Ionen-Anti- oder Symport und dem ZuckerPhosphotransferase- (PTS) System. Die hochaffinen Bindungsproteine verhindern die Diffusion einmal eingedrungener oder durch die Cytoplasmamembran verlorene Substrate aus dem Periplasma heraus und unterstützen so deren Akkumulation im Zellinneren. Zu dem Transportsystem gehören außer dem Bindungsprotein eine Pore in der Äußeren Membran, zwei an der cytoplasmatischen Seite der Membran exponierte Proteine mit der ATPbinding casette und zwei an der periplasmatischen Seite an die Membran assoziierte Proteine, die die mit der cytoplasmatischen Hydrolyse des ATP gewonnene Energie ins Periplasma weiterleiten (Boos und Lucht, 1996). 75 Die entsprechenden Gene sind zwar alle in einem Operon zusammengefaßt, das Bindungsprotein liegt allerdings an erster Position und ist durch eine REP-(repetetive extragenic palindrom)-Sequenz von den anderen Cistrons abgetrennt. Diese schützt es vor Degradation, so daß von der polycistronischen mRNA oft nur das erste Cistron übrig bleibt. Dies führt z.B. im Falle von MalE zu einen hundertfachen Überschuß über die Membrankomponente MalF (Boos und Lucht, 1996). Die besondere Stabilität der REP-geschützten mRNA hängt von DnaK ab; ohne DnaK ist beispielsweise die mglB-mRNA weniger stabil (el Yaagoubi et al., 1996). Es ist jeweils das erste Cistron der polycistronischen mRNA von mglBAC, malEFG und hisJPQ betroffen.

94

4. Ergebnisse und Diskussion

Die intrazellulären Proteinkonzentrationen reagierten langsamer als die Bildungsgeschwindigkeiten; es war jedoch eine deutliche Verringerung der spezifischen Konzentrationen für die periplasmatischen Proteine festzustellen. In der Vollständigkeit und der Schnelligkeit des Verlustes unterschieden sich die einzelnen Proteine (s. Abb. 28 A). Die Konzentration des Galaktose-Bindungsproteins (MglB) erreichte innerhalb einer halben Stunde die Nachweisgrenze, während das Arginin-Bindungsprotein (ArgT) nach einer Stunde auf die Hälfte des Vorinduktionsniveaus reduziert war, diesen Wert aber stabil hielt. Für einige Proteine waren die Verluste in produzierenden Zellen ausgeprägter als in Kontrollzellen. Besonders deutlich wurde dies für zwei Proteine, die sich auch im zellfreien Kulturüberstand fanden (Abb. 28 B).

A) 6

spezifische Konzentration /mg g

-1

4

2

0

B) 3

2

1

0 0

2

4

6

8

tind /h Abb. 28: Kinetik des Verlusts periplasmatischer Proteine Intrazelluläre Konzentrationen von periplasmatischen Proteinen; volle Symbole: Standardkultivierung, offene Symbole: Kontrollkultivierung A) Kreise: Galaktose-Bindungsprotein (MglB), Quadrate: Arginin-Bindungsprotein (ArgT) B) Kreise: Glutamin-Bindungsprotein (GlnH), Quadrate: ein nicht identifiziertes Protein, das im Medium gefunden wird.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

95

Für einige Proteine wurde sogar ein leichter Anstieg der Konzentrationen in der Kontrollkultivierung gefunden, obwohl sie in der Standardkultivierung abnahmen, z. B. die Bindungsproteine für Histidin (HisJ), für verzweigte Aminosäuren (LivJ) oder für Ribose (RbsB). Bei den Bindungsproteinen für Maltose (MalE), Dipeptide (DppA) und Oligopeptide (OppA) war nur ein leichter, in allen (sowohl Standard- als auch Kontroll-) Kultivierungen ähnlicher Rückgang zu verzeichnen. Die Bindungsproteine bestehen aus zwei globulären Domänen mit einer molaren Masse zwischen 20 und 40 kDa. Ausnahmen sind u. a. DppA und OppA, die eine dritte Domäne besitzen und deshalb größer sind (Oliver, 1996). Das geringere Austreten von DppA und OppA in den Kulturüberstand mag in ihrer Größe begründet liegen. Als Ursachen für den Rückgang der intrazellulären Konzentrationen kommen neben der verringerten Bildungsgeschwindigkeit der periplasmatischen Proteine Degradation und Verlust in den zellfreien Kulturüberstand in Betracht. Proteolyse durch die periplasmatische Protease DegP kann höchstens einen Teil des beobachteten Rückgangs bewirken76. Nach dem Temperatursprung akkumulierten im zellfreien Kulturüberstand periplasmatische Proteine (nicht gezeigt). Die am Kultivierungsende gefundenen Proteinkonzentrationen entsprechen 30% des periplasmatischen Proteins der dann vorliegenden Biomasse. Der Verlust von Proteinen wird daher als Hauptursache des Rückgangs der intrazellulären Konzentration angesehen. Die Proteinkonzentration im Periplasma ist so hoch, daß es auch als Gel bezeichnet wird: freies Wasser ist fast vollständig ausgeschlossen. Daher sind periplasmatische Proteine besonders bei höheren Temperaturen sehr aggregationsgefährdet. Nicht-transiente Akkumulation aggregierter Proteine im Cytoplasma kann zur Zerstörung der Inneren Membran führen (Kucharczyk et al., 1991). Möglicherweise ist der Schutz der Membran eine Hauptaufgabe ATPabhängiger Chaperone77. ATP-abhängige Chaperone kommen im Periplasma nicht vor, da ATP nur im Cytosol zu finden ist. Andere Mechanismen müssen die Aggregation von Proteinen im Periplasma verhindern. Denaturierte Proteine im Periplasma werden durch die in der Inneren Membran lokalisierte DegP-Protease (auch HtrA genannt) abgebaut (Oliver, 1996). Sie ist überlebenswichtig für

DegP wird durch den alternativen Hitzeschock-Sigmafaktor σE kontrolliert. Das σE-abhängige Regulon wird normalerweise erst bei höheren Temperaturen als 42°C induziert. Die Proteolyse wird also nicht die Hauptursache des Rückgangs der Konzentrationen sein. 77 Chaperone wie GroEL (Török et al., 1997) und DnaK (el Yaagoubi et al., 1994) binden an die Innere Membran, zum einen um deren Fluidität bei höheren Temperaturen zu reduzieren, zum anderen möglicherweise auch, weil Proteinaggregate dort den unmittelbarsten Schaden anrichten. In anderen Organismen gibt es mehrere DnaK-Varianten, von denen eine ganz an der Membran sitzt (Nimura et al., 1996). Auch andere, kleine Hitzeschockproteine sitzen membranassoziiert in Leuconostoc oenos (Jobin et al., 1997). Durch einen Hitzeschock aggregierte β-Galaktosidase kann ins Periplasma transloziert werden, vermutlich aufgrund der exponierten Hydrophobizität (Umakoshi et al., 1998). Es ist vorstellbar, daß dies allgemein der Grund für die Wechselwirkung zwischen denaturierten Proteinen und Membranen ist. 76

96

4. Ergebnisse und Diskussion

Temperatur über 42°C (Oliver, 1996), weil ohne sie die Integrität der Zellhülle bei hoher Temperatur nicht gewährleistet werden kann (Conolly et al., 1997). Interessant zu bemerken ist, daß der Verlust periplasmatischer Proteine in Mutanten ohne Lipoprotein Lpp, das die Äußere Membran an den Mureinsacculus bindet, den konditional-letalen Effekt von degPMutationen bei nicht-permissiver Temperatur supprimiert (Oliver, 1996). Die Akkumulation aggregierender Proteine im Periplasma ist für E. coli demnach schädlicher als ein Verlust der periplasmatischen Proteine. Allgemein werden Proteine (und andere Substanzen) bei Streß in den Kulturüberstand abgegeben; die Geschwindigkeit ist bei hohen Temperaturen größer (Roshchina und Petrov, 1997). Es handelt sich um eine unspezifische Streßantwort. Einige Hinweise auf die Ursache werden in der Literatur gegeben: Schnelle Produktion von β-Laktamase kann zur Aggregation der β-Laktamase im Periplasma und zum Austreten periplasmatischer Proteine ins Medium führen (Georgiou et al., 1988). Es wurde gezeigt, daß Mutationen der β-Laktamase, die den Verlust periplasmatischer Proteine verringern, und solche, die die Aggregation des Proteins vermindern, an unterschiedlichen Stellen im Protein liegen (Knappik und Plückthun, 1995). Es ist also nicht die Aggregation selbst, die das Austreten periplasmatischer Proteine verursacht. Überexpression periplasmatischer Proteine verhindert den Export zelleigener Proteine78 und die Aufrechterhaltung der Integrität der Äußeren Membran79. Nach dem Temperatursprung erhöhte sich die Bildungsgeschwindigkeit von β-Laktamase durch den Anstieg des Plasmidmassenanteil besonders in der Kontrollkultivierung stark (s. 4.2.3.3). In der Standardkultivierung konnte eine mögliche Limitierung durch die GroELVerfügbarkeit aufgehoben werden; dort war der Anteil der prozessierten an der insgesamt produzierten β-Laktamase höher als in der Fed-Batch-Phase I oder als in der Kontrollkultivierung. Die Exportgeschwindigkeit der β-Laktamase war danach in Standard- und Kontrollkultivierung gleich. Sowohl in Standard- als auch Kontrollkultivierungen kann also die erhöhte β-Laktamase-Produktion andere, zelleigene Proteine von den Exportstellen in der Membran verdrängen und deren Export vermindern. Daneben ist es vorstellbar, daß bei DnaK-Mangel (der in der Standardkultivierung anhielt, erkennbar an der fortlaufenden Hitzeschockantwort, s. 4.2.4.1) denaturierte Proteine an Cha-

78

Störungen des Exportmechanismus treten auf, wenn die Bildungsgeschwindigkeiten zu exportierender Proteine die Exportkapazität überschreitet, z. B. bei Mutanten im Sec-System (Verringerung der Exportkapazität) oder bei Überproduktion periplasmatischer Proteine (Kadokura et al., 1995). Prä-Proteine blockieren irreversibel die Transportwege und akkumulieren in der Inneren Membran (Kadokura et al., 1995). 79 Unter solchen Umständen können keine Lipoproteine exportiert werden, und die Lipid-Synthese wird unterdrückt. Zur Anpassung der Membran an erhöhte Temperatur ist aber der Einbau von Lipiden mit stärker gesättigten Fettsäuren erforderlich.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

97

perone, deren erste Aufgabe der Proteinexport ist, binden80. In der Standardkultivierung können Proteine, die auf solche Chaperone angewiesen sind, also auch auf der Ebene der Aufrechterhaltung der Translokationskompetenz limitiert sein. Beide Faktoren können zu einer Störung des Exports zelleigener Proteine, besonders des Lipoproteins Lpp und von Proteinen der Äußeren Membran, führen. Daher wird der Verlust der Fähigkeit, Proteine zu exportieren, als Hauptursache für eine vermutete Instabilität der Äußeren Membran81 und den beobachteten Verlust von periplasmatischen Proteinen ins Medium angesehen. 4.2.7 Metabolische Enzyme Die Isocitrat-Dehydrogenase (IcdE) ist ein Schlüsselenzym des Tricarbonsäurezyklus (TCA). Sie steuert die Aufteilung zwischen der Energie- und Bausteine-liefernden Funktion des TCA (Abb. 29). Bei Wachstum auf Acetat oder Fettsäuren ist sie unabdingbar; bei Mangel an phosphorylierten Zuckern wird sie zusammen mit Enzymen der Glukoneogenese und des Glyoxylat-Weges induziert (Saier et al., 1996). Während der Fed-Batch-Phase I war die Isocitrat-Dehydrogenase eines der meistgebildeten Proteine. Sie machte etwa 4% der Gesamtproteinsynthese (entsprechend 2,5 mg g-1 h-1) aus. Direkt nach dem Temperatursprung fiel die Bildungsgeschwindigkeit sowohl in Standard- als auch Kontrollkultivierung plötzlich stark ab (Abb. 30). Nach fünf Minuten wurde ein Minimum von weniger als 1 mg g-1 h-1 durchschritten. Innerhalb einer halben Stunde erholte sich die Bildungsgeschwindigkeit auf den alten Wert (Abb. 30). Auf die Konzentration hatte der kurze Einbruch der Bildungsgeschwindigkeit direkt nach dem Temperatursprung keinen Einfluß: sie blieb konstant und stieg später sogar leicht (nicht gezeigt).

80 Zu exportierende Proteine werden durch SecB in einer translokationskompetenten Form gehalten. SecB erkennt seine Substrate kinetisch: das Signalpeptid verzögert die Faltung zu exportierender Proteine und erlaubt die Bindung von SecB, während cytoplasmatische Proteine schnell in die native Konformation falten, die nicht an SecB binden kann (Hardy und Randall, 1991). Manche Proteine, wie z. B. MglB, sind neben SecB auch direkt auf freies DnaK angewiesen (el Yaagoubi et al., 1996). 81 Proteine der Äußeren Membran werden in NEpHE-Gelen nicht gefunden, da sie durch das zu verwendende chaotrope Reagenz Harnstoff nicht solubilisiert werden. In 1D-SDS-Gelen findet man unmittelbar nach dem Temperatursprung um 25% reduzierte Bildungsgeschwindigkeiten von OmpA, einem Protein der Äußeren Membran. In der Kontrollkultivierung erholte sich die Bildungsgeschwindigkeit innerhalb von 30 min vollständig, in der Standardkultivierung fiel sowohl die absolute Bildungsgeschwindigkeit als auch der Anteil der OmpA-Bildungsgeschwindigkeit an der Gesamtproteinsynthese langsam weiter. Vier Stunden nach dem Temperatursprung war in der Standardkultivierung keine OmpA-Bildung mehr nachzuweisen. In Schüttelkolbenexperimenten mit TG1 pλFGFB betrug die OmpA-Bildungsgeschwindigkeit ab 20 min nach dem Temperatursprung nur noch ein Drittel der Bildungsgeschwindigkeit bei 30°C.

98

4. Ergebnisse und Diskussion

Abb. 29: Schema des Tricarbonsäurezyklus Die Bezeichnungen der (Untereinheiten der) betrachteten Proteine sind angegeben. Promotoren von „Haushaltsgenen“ werden vom Sigma-Faktor σ70 erkannt. Dieser wird unter Hitzeschockbedingungen durch σ32 von der Kern-RNA-Polymerase verdrängt, wodurch es zu einer Minderproduktion der Haushaltsproteine kommt (Abb. 14 auf S. 66). Möglicherweise spielt auch die Konkurrenz mit den reichlich vorhandenen Hitzeschockprotein-mRNAs um Ribosomen eine Rolle. In der Standardkultivierung hielten die Streßbedingungen an, und die Bildungsgeschwindigkeiten von Haushaltsproteinen wie z. B. EF-Tu als Teil des Proteinproduzierenden Systems stabilisierten sich auf niedrigem Niveau (Daten aus Abb. 16 zum Vergleich als Trendlinien in Abb. 30 wiederholt). Die Hitzeschock-verursachte Minderproduktion ging in der Kontrollkultivierung vorüber; diesem Effekt überlagerte sich ein etwa linear mit der Zeit abfallender Trend (Trendlinien für EF-Tu in Abb. 30). Darin kann eine Anpassung an die beim Temperatursprung verringerte Zufütterungsrate gesehen werden. Die Haushaltsprotein-Bildungsgeschwindigkeiten waren also auch in der Kontrollkultivierung nach dem Temperatursprung kleiner als in der Fed-Batch-Phase I. Im Gegensatz dazu findet man für die Isocitrat-Dehydrogenase eine vollständige Erholung: dreißig Minuten nach dem Temperatursprung wurde sie sowohl in Standard- als auch Kontrollkultivierung mit der gleichen Bildungsgeschwindigkeit wie in der Fed-Batch-Phase I ge-

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

99

bildet. Offensichtlich kann dieses wichtige metabolische Protein auch unter Streßbedingungen

-1

Bildungsgeschwindigkeit /mg g h

-1

auf das benötigte Niveau reguliert werden.

4,0

1,8

3,5 3,0 1,2

2,5 2,0 1,5

0,6

1,0 0,5 0,0 0,0

0,5

1,0

1,5

0,0 2,0

tind /h

Abb. 30: Transiente Minderproduktion der Isocitrat-Dehydrogenase Isocitrat-Dehydrogenase (IcdE; linke Achse, Symbole und durchgezogene Trendlinie). Geschlossene Symbole: Standardkultivierung, offene Symbole: Kontrollkultivierung. Zum Vergleich: Trendlinien für die Bildungsgeschwindigkeiten von EF-Tu (rechte Achse, gestrichelte Linie: Kontrollkultivierung, gepunktete Linie: Standardkultivierung, vgl. Abb. 16). Die Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (kodiert durch lpdA) ist als E3-Untereinheit in zwei zentralen Enzymkomplexen der Glukose-Oxidation vertreten; sie kommt im PyruvatDehydrogenase-Komplex und in der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase vor (LpdA in Abb. 29). Sie machte in der Fed-Batch-Phase I nur 0,5% der Gesamtproteinsynthese aus. Sie wurde nach dem Temperatursprung zeitweilig mit fünffach höherer Geschwindigkeit gebildet. Ein breites Maximum wurde gut eine Stunde nach dem Temperatursprung durchlaufen, und erst vier bis fünf Stunden später wurde die ursprüngliche Bildungsgeschwindigkeit wieder erreicht (Abb. 31). Der Verlauf war dabei für die Kontrollkultivierung sehr ähnlich wie für die Standardkultivierung. Einen vergleichbaren Trend wiesen neben einem nicht-identifizierten Protein auch die Untereinheit SdhA der Succinat-Dehydrogenase (nicht gezeigt) und die Tryptophanase (TnaA, Abb. 31) auf. Die Bildungsgeschwindigkeit der Tryptophanase ging in der Standardkultivierung schneller zurück als in der Kontrollkultivierung.

100

4. Ergebnisse und Diskussion

Auch im Vergleich mit den Enzymen LpdA und SdhA des Tricarbonsäurezyklus, die unter den vorliegenden Bedingungen eine wichtige Funktion erfüllen, ging die Bildungsgeschwindigkeit der Tryptophanase TnaA in der Standardkultivierung schneller zurück. Die Tryptophanase ist für die Verwertung von Tryptophan als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zuständig. Sie wurde vier Stunden nach dem Temperatursprung in der Standardkultivierung nicht mehr gebildet (Abb. 31). Die Bildung von TnaA wird durch CRP positiv reguliert und durch Attenuation verringert (Landick et al., 1996). Der Rückgang der Bildungsgeschwindigkeit von

1,2

-1

Bildungsgeschwindigkeit /mg g h

-1

TnaA kann durch einen Mangel an Tryptophan oder Ribosomen verursacht sein.

0,8

0,4

0,0

0

2

4

6

8

tind /h Abb. 31: Induktion metabolischer Proteine Quadrate: Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (LpdA), Dreiecke: Tryptophanase (TnaA). Geschlossene Symbole: Standardkultivierung, offene Symbole: Kontrollkultivierung. Trendlinie: durchgezogen (TnaA in Kontrollkultivierung, LpdA), gepunktet: TnaA in Standardkultivierung. Bei Temperatursprüngen innerhalb des Arrhenius-Bereichs stellt sich die Wachstumsrate, die der neuen Temperatur entspricht, sofort ein; die Anpassung erfolgt also über Modifikation der Enzymaktivität (Neidhardt und VanBogelen, 1987). Bei Sprüngen auf Temperaturen außerhalb des Arrhenius-Bereichs gibt es eine Verzögerung in der Anpassung der Wachstumsrate, weil Änderungen bei der Proteinsynthese notwendig werden. Insbesondere werden die Bildungsgeschwindigkeiten der Proteine des Protein-produzierenden Systems reduziert, die Bildungsgeschwindigkeiten der Proteine des Energiemetabolismus dagegen stark erhöht (Neid-

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

101

hardt und VanBogelen, 1987). Die Autoren führen das auf den erhöhten Energiebedarf bei Temperaturen außerhalb des Arrhenius-Bereichs zurück. Einige metabolische Enzyme werden als Teil von Streßantworten induziert82. Die Kinetik der Induktion von LpdA, SdhA und TnaA wich aber deutlich vom Verlauf der Hitzeschockantwort (s. 4.2.4.2) ab. Das Maximum der LpdA-Bildungsgeschwindigkeit wurde erst nach einer Stunde erreicht; die Reduktion der Bildungsgeschwindigkeiten zog sich über mehrere Stunden hin. Die Synthese dieser Proteine wird demnach nicht über die Temperatur selbst reguliert. Die Transkription der betrachteten Enzyme TnaA, LpdA und SdhA wird durch CRP (cAMP receptor protein) positiv reguliert. CRP selbst wird durch cAMP (2‘,3‘-cyklisches AdenosinMonophosphat) aktiviert und fördert dann auch seine eigene Synthese. Die intrazelluläre Akkumulation von cAMP ruft eine schnelle Antwort über die Aktivierung von CRP hervor. Die Antwort wird durch die positive Autoregulation von CRP verstärkt. Die Verstärkung ist langsamer, weil Proteinsynthese erforderlich ist. Zur Akkumulation von cAMP kommt es bei Glukose- und Energiemangel. Die Induktion der cAMP/CRP-kontrollierten Gene (Abb. 31) zeigt also einen Energiemangel nach dem Temperatursprung an. LpdA und SdhA sind Untereinheiten von Enzymen des TCA, in dem unter aeroben Bedingungen die meiste Energie gewonnen wird. Die Atmungsaktivität wird durch Enzyme des Tricarbonsäurezyklus (TCA) bestimmt. Die mit der Atmungsaktivität verbundenen Größen (Sauerstoffaufnahmerate OUR und Kohlendioxidbildungsrate CER bzw. die entsprechenden Ausbeutekoeffizienten) stiegen innerhalb einer Stunde nach dem Temperatursprung auf ihr neues Niveau (vgl. Abb. 34 auf S. 109). Das Erreichen eines neuen quasi-stationären Wertes für die Ausbeutekoeffizienten der Atmungsraten nach einer Stunde zeigt an, daß diese Atmungsraten zur Bereitstellung der benötigten Energie ausreichten. Nach einer Stunde war auch das Maximum der LpdA- und SdhA-Bildungsgeschwindigkeiten erreicht. Danach ließ die Induktion nach. Die Induktion cAMP/CRP-kontrollierter Gene stimmte also mit dem Zeitrahmen überein, den die Atmungsraten zum Erreichen ihres neuen Wertes benötigten. Auch dieser Befund legt nahe, daß die Bildungsgeschwindigkeiten dieser Enzyme über die Energieverfügbarkeit reguliert werden und die Atmungsraten in der ersten Stunde nach dem Temperatursprung durch die Aktivität der Enzyme limitiert83 werden.

82

Beispielsweise ist die PEP-Synthase ein Hitzeschockprotein (Neidhardt und VanBogelen, 1987); Glukokinase wird als Antwort auf die Bildung eines rekombinanten Proteins induziert (Arora und Pedersen, 1995) 83 In Kultivierungen mit schnellerer Glukose-Zufütterung bei 42°C akkumulierten zunächst Glutamat, später Pyruvat und Laktat, zuletzt auch Alanin im zellfreien Kulturüberstand (nicht gezeigt). Dies könnte dafür sprechen, daß α-Ketoglutarat und Pyruvat nicht effektiv metabolisiert werden und zu Glutamat bzw. Alanin transaminiert bzw. zu Laktat reduziert werden. Die einschlägigen Enzyme (α-Ketoglutarat- und Pyruvat-DehydrogenaseKomplexe) enthalten LpdA als Untereinheit E3 und scheinen den katabolen Fluß zu limitieren.

102

4. Ergebnisse und Diskussion

Ein Energiemangel insbesondere in den ersten vierzig Minuten nach dem Temperatursprung wird durch ein Absinken des AEC84 angezeigt (nicht gezeigt). Der AEC erreichte ab einer Stunde nach dem Temperatursprung fast den Wert der Fed-Batch-Phase I. Innerhalb dieses Zeitraums gingen die Enzym-Bildungsgeschwindigkeiten wieder langsam auf das Vorinduktionsniveau zurück (Abb. 31). Auch dies unterstreicht, daß die Expression der cAMP/CRPkontrollierten Gene nicht direkt über die Temperatur, sondern über die Energieverfügbarkeit reguliert werden.

300 250

cAMP /µM

200 150 100 50 0 -25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

tind /h

Abb. 32: Konzentration des Signalmoleküls cAMP im Kulturüberstand Geschlossene Symbole: Standardkultivierung, offene Symbole: Kontrollkultivierung. Linien: Grenze zwischen Batch-Phase, Fed-Batch-Phase I bzw. Fed-Batch-Phase II. Während der

Fed-Batch-Phase I

akkumulierte cAMP

(2‘,3‘-cyclisches

Adenosin-

Monophosphat) im Kulturüberstand (Abb. 32; gemessen von A. Kayser). Die Steigung war dabei für Standard- und Kontrollkultivierung etwa gleich. Ob der Unterschied der absoluten Konzentration signifikant ist, kann nicht gesagt werden. Nach dem Temperatursprung fielen die Konzentrationen ab. In der Standardkultivierung war der Abfall steiler als in der Kontroll-

84

Der AEC (Adenylate Energy Charge als Maß für die Energieladung der Zelle) berechnet sich aus den Konzentrationen der Adenylate-Nukleotide nach AEC = ([ATP]+0,5*[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP]). Meßwerte für Standardkultivierungen wurden von A. Kaiser (1998), für Kontrollkultivierungen von J. Weber (laufende Dissertation) bestimmt.

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

103

kultivierung. Erst etwa sechs Stunden nach dem Temperatursprung fiel die Konzentration auch in der Kontrollkultivierung mit der gleichen Steigung wie in der Standardkultivierung85. Die intrazelluläre Konzentration an cAMP wird durch zwei Mechanismen reguliert: bei kleiner Glukose-Aufnahmerate wird die Adenylat-Zyklase allosterisch durch die phosphorylierte Komponente IIAGlc des Phosphotransferase-Systems aktiviert (s. 2.1.3). Solange genügend Energie zur Aufrechterhaltung des Membranpotentials vorhanden ist, wird cAMP aber ins Medium ausgeschleust (Saier et al., 1996). Die intrazelluläre cAMP-Konzentration wird also über die Glukose-Aufnahmerate und die Energieverfügbarkeit reguliert. Die Daten in Abb. 32 sind konsistent mit folgender Vorstellung: in der Fed-Batch-Phase I ist die Glukose-Aufnahmerate so gering, daß die Adenylat-Zyklase aktiviert wird. Da das Membranpotential intakt ist, wird cAMP in den Kulturüberstand ausgeschleust. Nach dem Temperatursprung verschärft sich der Energiemangel (erkennbar am Abfall des AEC), so daß der Efflux unterbunden wird. Möglicherweise wird cAMP als zusätzliche Kohlenstoffquelle wieder aufgenommen. Die extrazelluläre Konzentration an cAMP geht in der Standardkultivierung schnell zurück; in der Kontrollkultivierung war der Abfall erst steiler, nachdem die Wachstumsrate unter einen Schwellenwert gefallen ist. Da die Zeitverläufe der Expression für cAMP/CRP-kontrollierte Gene in Standard- und Kontrollkultivierung gleich waren, wird die intrazelluläre cAMP-Konzentration in beiden Fällen vergleichbar sein. Die gemessenen extrazellulären Konzentrationen bestätigen, daß cAMP/CRP-kontrollierte Gene nicht in der Fed-Batch-Phase I, wohl aber nach dem Temperatursprung in beiden Kultivierungen induziert werden. Proteine des Protein-produzierenden Systems wurden nach dem Temperatursprung mit deutlich geringerer Rate gebildet als in der Fed-Batch-Phase I; die Bildungsgeschwindigkeiten erholten sich in der Kontrollkultivierung partiell, in der Standardkultivierung blieben sie konstant niedrig. Genau entgegengesetzt wurden rpoH-abhängige Hitzeschockproteine in der Standardkultivierung dauerhaft, in der Kontrollkultivierung vorübergehend induziert. Isocitrat-Dehydrogenase teilt mit anderen Haushaltsproteinen die Repression nach dem Temperatursprung, wurden danach aber in Standard- und Kontrollkultivierung wieder induziert.

85

Zu dieser Zeit stieg in der Kontrollkultivierung die Konzentration (aus Coomassie-gefärbten 2D-Gelen bestimmt) der 2‘,3‘-cyclische-Nukleotid-Phosphodiesterase an, die cAMP als Kohlenstoffquelle nutzbar macht (nicht gezeigt). In Standardkultivierungen fanden sich keine höheren Konzentrationen, möglicherweise weil das Enzym als periplasmatisches Protein in den Kulturüberstand verloren wird.

104

4. Ergebnisse und Diskussion

Katabolische Enzyme müssen auf ihrem Niveau gehalten oder sogar induziert werden, um den höheren Energiebedarf der (Temperatur-)gestreßten Zelle zu bewältigen. Die Induktion war auch in der Standardkultivierung bei der starken Beanspruchung des Protein-produzierenden Systems durch bFGF- und Hitzeschockprotein-Synthese im gleichen Ausmaß wie in der Kontrollkultivierung möglich. Auf Seiten der Bildungsgeschwindigkeiten metabolischer Enzyme unterschieden sich die Kultivierungen nicht. Es wird daraus geschlossen, daß der Primärmetabolismus und die Energiegewinnung keine entscheidende Rolle bei der verringerten Vitalität der bFGF-produzierenden Zellen spielen. Anders als die Bildungsgeschwindigkeiten der Untereinheiten LpdA bzw. SdhA von Pyruvatund α-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplex bzw. Succinylat-Dehydrogenase, die unter den Bedingungen erhöhten Energiebedarfs gesteigert wurden, stieg die Bildungsgeschwindigkeit der Isocitrat-Dehydrogenase „nur“ auf das Niveau der Fed-Batch-Phase I. IcdE wird durch FruR positiv reguliert. FruR reprimiert die Bildung von Enzymen der Glykolyse und des Entner-Doudoroff-Weges und induziert die Bildung von Enzymen des Tricarbonsäurezyklus, des Glyoxylat-Nebenweges und der Glukoneogenese, wenn ungenügend phosphorylierte Zucker vorliegen. Es kontrolliert also die Aufteilung der Stoffflüsse zwischen Ana- und Katabolismus. Möglicherweise wird die Isocitrat-Dehydrogenase unter den vorliegenden Bedingungen hauptsächlich durch diesen Regulator kontrolliert. Daß IcdE in Standard- und Kontrollkultivierung mit gleicher Geschwindigkeit gebildet wird, spricht dafür, daß die Balance zwischen Ana- und Katabolismus auch unter Streßbedingungen aufrechterhalten wird. Die verstärkte Atmungsaktivität ist demnach nicht Ausdruck eines unkontrollierten Katabolismus oder einer Energievernichtung durch „futile cycling“; vielmehr wird sie durch einen erhöhten Energiebedarf hervorgerufen. Dies bestätigt, daß der Stopp von Wachstum und Nettoakkumulation von bFGF wenige Stunden nach dem Temperatursprung in der Standardkultivierung nicht durch einen gestörten Metabolismus oder Probleme bei der Energiegewinnung verursacht wird, sondern auf dem erhöhten Energiebedarf zur Synthese, Faltung und ATP-abhängigen Degradation von bFGF und zur Bildung von Hitzeschockproteinen und konstitutiv synthetisierten Plasmid-kodierten Proteinen beruht. 4.2.8 Anteil nicht-wachstumsfördernder Proteine an der Gesamtproteinsynthese Nach dem Temperatursprung produzieren die Zellen sowohl in den Standard- als auch in den Kontrollkultivierungen Proteine, die nicht zum Wachstum und damit zusammenhängenden Funktionen wie Energiegewinnung, Polymerisation von Makromolekülen etc. benötigt werden. In erster Linie sind dies die Plasmid-kodierten Proteine, neben bFGF also der Repressor

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

105

cI und der Resistenzmarker β-Laktamase. Aber auch die Hitzeschockproteine sind nicht für das Wachstum, sondern für die Zellerhaltung notwendig (Hesterkamp und Bukau, 1998). Die Summe der Bildungsgeschwindigkeiten dieser Proteine wurde auf die Summe der Bildungsgeschwindigkeiten aller Proteine bezogen; sie machten nach dem Temperatursprung in allen Kultivierungen einen Großteil der Gesamtproteinsynthese aus (Abb. 33). 100 80

Anteil an der Gesamttranslation /%

60 40 20 0 80

60

40

20

0 0

2

4

6

tind /h Abb. 33: Anteil nicht-wachstumsfördernder Proteine an der Gesamtproteinsynthese Oben: Standardkultivierung, unten: Kontrollkultivierung. Anteil der Bildungsgeschwindigkeiten von bFGF und einem bFGF-Fragment (durchgezogenen Linie), von konstitutiv synthetisierten Plasmid-kodierten Proteinen (je zwei Formen von β-Laktamase und Repressor cI; gestrichelte Linie) und von Hitzeschockproteinen (DnaK, DnaK-Fragment, GroEL, GroES, ClpB, ClpB‘, HtpG, DnaJ und GrpE; gepunktete Linie) an der gesamten Proteinsynthese. Symbole: Summe der Anteile. Geschlossene Symbole: Standardkultivierung, offene Symbole: Kontrollkultivierung, Kreuze: aus der linearen Beziehung zwischen Plasmidmassenanteil und Bildungsgeschwindigkeit Plasmid-kodierter Proteine interpolierte Werte auf Basis des gemessenen Plasmidmassenanteil in der Kontrollkultivierung.

106

4. Ergebnisse und Diskussion

Während die Hitzeschockproteine vor dem Temperatursprung etwa 7,5% der Gesamtproteinsynthese ausmachten, stieg ihr Anteil während der Hitzeschockantwort auf über 55%. In der Standardkultivierung wurde ein hoher Wert bis zum Kultivierungsende beibehalten; in der Kontrollkultivierung ging er wie oben (4.2.4.3) beschrieben zurück. Der Plasmidmassenanteil und die dazu proportionalen Bildungsgeschwindigkeiten des Repressors cI und der β-Laktamase stiegen in der Kontrollkultivierung mit der Zeit immer stärker an (s. 4.2.3.1 bzw. 4.2.3.3). Fünf Stunden nach dem Temperatursprung machten die Bildungsgeschwindigkeiten konstitutiv synthetisierter Plasmid-kodierter schon 50% der Proteinsynthese aus und wiesen steigende Tendenz auf (Abb. 33). Vielfach ist beschrieben, daß die Synthese eines rekombinanten Proteins auf der Translationsebene limitiert ist (Srivastava und Volesky, 1990; Wood und Peretti, 1991; Vind et al., 1993; Laffend und Shuler, 1994). Die beschriebenen Ergebnisse zeigen, daß auch der Umkehrschluß gültig ist: wegen der erzwungenen Herstellung nicht-wachstumsfördernder Proteine wird die Synthese zelleigener Proteine limitiert (vgl. Abb. 14). Trotz der nach dem Temperatursprung deutlich erhöhten Proteinsyntheseleistung (s. 4.2.2.1) blieben nur wenig Ressourcen für die Herstellung zelleigener Proteine übrig. Nicht nur das rekombinante Zielprotein, sondern auch konstitutiv synthetisierte Plasmid-kodierte Proteine (in der Kontrollkultivierung) und die durch bFGF am Abklingen gehinderte Hitzeschockantwort (in der Standardkultivierung) beanspruchten einen erheblichen Anteil an der Proteinsynthese. Oft wird der physiologische Zustand eines rekombinanten Bakteriums über die „Stoffwechsellast“, dem Bedarf an Bausteinen und Energie zur Erhaltung des Plasmids und zur Synthese des rekombinanten Proteins, beschrieben. In dieser Arbeit (Abb. 33) wird gefunden, daß es drei Gruppen nicht-wachstumsfördernder Proteine sind, deren Synthese das Wachstum rekombinanter Bakterien beschränkt: erstens Hitzeschockproteine, die durch den Temperatursprung transient und im Falle der Standardkultivierung durch bFGF permanent induziert wurden, zweitens die konstitutiv synthetisierten Plasmid-kodierten Proteine und drittens in der Standardkultivierung das induzierbare Plasmid-kodierte rekombinante Protein. Das rekombinante Protein selbst machte nur einen Teil der Stoffwechsellast aus; in der Kontrollkultivierung erreichten die konstitutiv synthetisierten Plasmid-kodierten Proteine einige Stunden nach dem Temperatursprung einen höheren Anteil an der Proteinsynthese als bFGF in der Standardkultivierung (Abb. 33). Das Konzept des „metabolic burden“ greift also zu kurz. Bentley et al. (1990) erkannten, daß Plasmid-kodierte Proteine den Hauptfaktor der Stoffwechsellast darstellen. Die Autoren fanden einen linearen Anstieg der Plasmidkopienzahl im steady state und des Anteils Plasmid-kodierter Proteine mit kleiner werdender Wachstumsra-

4.2. Bildungsgeschwindigkeiten und Konzentrationen von Proteinen

107

te. Dies stimmt mit den in 4.2.3.1 vorgestellten Ergebnissen überein: in der Kontrollkultivierung ließ sich der Plasmidmassenanteil als lineare Funktion der Wachstumsrate beschreiben. Diese lineare Beziehung gilt also nicht nur unter steady state Bedingungen, sondern – wie hier gezeigt wurde - auch unter dynamischen Verhältnissen: bei abfallender Wachstumsrate steigt der Plasmidmassenanteil. Die Bildungsgeschwindigkeiten der konstitutiv synthetisierten Plasmid-kodierten Proteine cI und β-Laktamase nahmen wegen des Gendosiseffekts zu und verringerten die Synthese zelleigener Proteine, damit also die Wachstumsrate. Die Dynamik dieses „autokatalytischen“ Prozesses führte dazu, daß einige Stunden nach dem Temperatursprung die Wachstumsrate in der Kontrollkultivierung kleiner als in der Standardkultivierung wurde. Ohne Induktion eines rekombinanten Proteins machten konstitutiv synthetisierte Plasmid-kodierte Proteine tatsächlich den Hauptanteil der Stoffwechsellast aus. In der Standardkultivierung wechselwirkte bFGF mit DnaKJ. Die Konzentration an freiem DnaKJ war begrenzt und die Hitzeschockantwort blieb permanent induziert. Vermutlich wegen des DnaKJ-Mangels stieg der Plasmidmassenanteil in der Standardkultivierung nicht entsprechend der verringerten Wachstumsrate an. Daher ist der Beitrag konstitutiv synthetisierter Plasmid-kodierter Proteine in der Standardkultivierung vernachlässigbar. Das rekombinante Protein und die Hitzeschockproteine machten hier etwa 80% der gesamten Proteinsynthese aus. Ein wesentlicher Anteil der „Stoffwechsellast“ wird nicht durch die Synthese des rekombinanten Proteins, sondern durch die aufgrund seiner Aggregationsneigung induzierten Hitzeschockproteine verursacht. Die Gesamtproteinsyntheseleistung der Zelle erhöhte sich nach dem Temperatursprung (vgl. 4.2.2.1). Da die Proteinsynthese der energieaufwendigste Schritt in der Zelle ist (Ingraham et al., 1983), muß das Verhältnis von Kata- und Anabolismus neu justiert werden. Obwohl die Bildungsgeschwindigkeiten anderer Haushaltsproteine nach dem Temperatursprung stark zurückgingen, konnten einige zentrale metabolische Enzyme nach einer kurzen Störung mit der vorherigen Geschwindigkeit gebildet oder sogar (im Falle einiger cAMP/CRP-kontrollierter Gene) induziert werden (s. 4.2.6). Die Kinetik der Induktion war in Standard- und Kontrollkultivierung sehr ähnlich. Es wird daraus geschlossen, daß die Anpassung an den erhöhten Energiebedarf auch parallel zur Produktion von rekombinanten Proteinen erfolgen kann. In der Folge war der Anteil YCO2 S der zugefütterten Glukose, der zur Energiegewinnung veratmet wurde, höher, entsprechend der Biomasse-Ausbeutekoeffizient Y X S kleiner. Zum einen wurde die Synthese zelleigener Proteine durch die Konkurrenz mit nichtwachstumsfördernden Proteinen um limitierende Ressourcen (Substrat, Translationskapazität)

108

4. Ergebnisse und Diskussion

reduziert. Zum anderen verringerte die an die erhöhte Gesamtproteinsynthese angepaßte Balance zwischen Ana- und Katabolismus die zur Biomasse-Synthese zur Verfügung stehende Menge an Substrat. Beide Effekte sind für die kleine Wachstumsrate nach dem Temperatursprung verantwortlich. Das Konzept der „Stoffwechsellast“ besagt, daß die Erhaltung des Plasmids und die Expression der darauf kodierten Gene Bausteine und Energie zusätzlich zum „normalen“ Stoffwechsel benötigen. Dabei werden andere Auswirkungen der Plasmidpräsenz und der Genexpression, wie z. B. der Verlust periplasmatischer Proteine in den Kulturüberstand oder ein anhaltender Chaperon-Mangel, vernachlässigt86. Hier wurde gezeigt, daß diese Vereinfachung im Prinzip zulässig ist: die beobachtete Wachstumsrate entspricht der Syntheserate zellulärer „Haushaltsproteine“. Für die energetische Betrachtung, also die Vorhersage der Verteilung der Ressourcen zwischen Katabolismus und Anabolismus, ist das Stoffwechsellast-Konzept geeignet, wenn man beachtet, daß das rekombinante Zielprotein nicht das einzige nicht-wachstumsfördernde Protein ist. Die beobachtete Wachstumsrate läßt sich quantitativ durch den daraus resultierenden Ausbeutekoeffizienten Y X S und die limitierend zugefütterte Glukose beschreiben. Zusätzliche Annahmen z. B. über die Zerstörung von Ribosomen, wie sie Dong et al. (1995), bei der Produktion eines rekombinanten Proteins beobachteten, brauchen zu diesem Zweck nicht hinzugezogen zu werden. 4.3

Online verfügbare Informationen zu Wachstum und Stoffwechsel

4.3.1 Kohlenstoffbilanz 4.3.1.1 Stoffströme und Ausbeutekoeffizienten Die zugefütterte Glukose verteilte sich in der Fed-Batch-Phase I auf Biomasse und Kohlendioxid. Für die Stoffströme (bezogen auf Mol Kohlenstoff) stellten sich konstante Werte ein. Nach dem Temperatursprung entwickelten sich die Ströme sehr dynamisch; die eine Stunde nach dem Temperatursprung gemessenen Werte sind in Tabelle 19 im Anhang gegeben. Die Wachstumsrate ist in Satzkultivierungen ein Maß für die Vitalität der Zellen. Sie kann sich im Fed-Batch-Prozeß aber nicht frei einstellen. Sie hängt allgemein mit der GlukoseAufnahmerate über den Ausbeutekoeffizienten Y X S , bezogen auf Glukose, zusammen. Dieser ist der Parameter, der die Leistungsfähigkeit des Mikroorganismus im Fed-Batch beschreibt.

86

Das Stoffwechsellast-Konzept betrachtet stöchiometrische Zusammenhänge; es wurde mit dem Erhaltungsenergiebedarf kombiniert, um kinetische Aussagen zu treffen. Zeitliche Veränderungen, die zu irreversiblen Schädigungen oder zum Verlust der Vitalität führen, werden nicht beschrieben.

4.3. Online verfügbare Informationen zu Wachstum und Stoffwechsel

109

Die Zeitverläufe der Ausbeutekoeffizienten Y X S und YCO2 S für Standard- und Kontrollkultivierung sind in Abb. 34 gegenübergestellt. Im Mittel lag für alle Kultivierungen vor dem Temperatursprung der Biomasse-Ausbeutekoeffizient bei Y X S = 0,58 ± 0,01 mol mol-1 und der Kohlendioxid-Ausbeutekoeffizient bei YCO2 S = 0,42 ± 0,01 mol mol-1. Nach dem Temperatursprung fiel der Biomasse-Ausbeutekoeffizient Y X S stark ab. In der Kontrollkultivierung erholte er sich innerhalb einer Stunde etwas und sank danach langsam weiter (Abb. 34 unten). In der Standardkultivierung wurde der niedrige Wert von 0,2 mol mol-1 bis zum Kultivierungsende beibehalten (Abb. 34 oben). 0,8 0,7 0,6

Ausbeutekoeffizienten /mol mol

-1

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -5

0

-5

0

5

10

5

10

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

tind /h Abb. 34: Ausbeutekoeffizienten für Biomasse und Kohlendioxid auf Kohlenstoffbasis, Biomasse mit einem Kohlenstoffanteil von 0,42 g g-1 umgerechnet. Oben: zwei Standardkultivierungen, unten: zwei Kontrollkultivierungen. Durchgezogen: YCO2 S , gestrichelt: Y X S .

110

4. Ergebnisse und Diskussion

Der Kohlendioxid-Ausbeutekoeffizient YCO2 S stieg entsprechend. In allen Kultivierungen lag er nach dem Temperatursprung um über 50% höher als in der Fed-Batch-Phase I bei 30°C. Nach dem Temperatursprung kam es also mit beiden Plasmiden, pλFGFB und pCytexP1, zu einem verstärkten Katabolismus. Dieses Phänomen war in den Standardkultivierungen noch ausgeprägter als in den Kontrollkultivierungen, der Unterschied zwischen beiden war aber deutlich kleiner als die Differenz zur Fed-Batch-Phase I bei 30°C. Die Summe von Y X S und YCO2 S war nach dem Temperatursprung kleiner als eins; dieser Differenz in der Kohlenstoffbilanz wird im folgenden nachgegangen. 4.3.1.2 Spezifische Verlustrate Der Verlauf für die spezifische „Verlustrate“ qVerlust = qS – qX – qCO2

(17)

ist in Abb. 35 gezeigt87.

2,0

1,2

-1

qVerlust /mmol g h

-1

1,6

0,8 0,4 0,0 -0,4 -4

-2

0

2

4

6

8

10

tind /h

Abb. 35: Spezifische Verlustrate als Differenz in der Kohlenstoffbilanz nach Gleichung 17 (Daten geglättet). Durchgezogene Linie: Standardkultivierungen, gepunktete Linie: Kontrollkultivierungen.

87

Die Biomasse-Bildungsrate wird aus dem Laugeverbrauch berechnet. Nach dem Temperatursprung war die Ammoniumkonzentration im Reaktor nicht mehr konstant, sondern fiel langsam ab. Die Konzentration lag beim Temperatursprung bei etwa 1 g L-1. Bei einem Kulturvolumen von maximal 30 L sind diese 30 g gegen die zur pH-Regelung zugefütterte Ammoniummenge (mindestens 1800 g) zu vernachlässigen.

4.3. Online verfügbare Informationen zu Wachstum und Stoffwechsel

111

In Standardkultivierungen war unmittelbar nach dem Temperatursprung eine konstante Verlustrate von 1 bis 1,4 mmol g-1 h-1 festzustellen, während die Verlustrate in den Kontrollkultivierungen zunächst nur langsam, später aber beschleunigt anstieg und zehn Stunden nach dem Temperatursprung größer war als in den Standardkultivierungen. Über die Art der verlorenen Substanzen ist nichts bekannt. Die im zellfreien Kulturüberstand gefundenen Aminosäuren und Proteine können die Verlustrate mengenmäßig nicht erklären. Über Redoxzustand und Energiegehalt der Substanzen versuchen die folgenden Bilanzen Aufschluß zu gewinnen. 4.3.2 Redoxbilanz Der Reduktionsgrad γi einer Substanz CHmOnNq ist nach Erickson et al. (1978) gegeben durch

γi = 4 + m – 2n – 3q.

(18)

Für Glukose ist γS = 4. Zur Reduktion von O2 zu Wasser werden vier Elektronen übertragen,

γO2 = 4. Die Redoxbilanz lautet also γ S ⋅ qS = γ X ⋅ q X + γ O 2 ⋅ qO 2 + γ Verlust ⋅ q Verlust

(19)

Aus dem Respirationsquotienten der Fed-Batch-Phase I, RQ = 1,07, berechnet man den Reduktionsgrad der Biomasse zu 4,18. Mit einer mittleren Zusammensetzung von E. coli CH1,8N0,23O0,512 (Anderson Da Silva und Bailey, 1986) wäre γX = 4,08, mit CH1,734N0,25O0,376 wie für TG1 in Hochzelldichtekultivierungen gemessen (Rinas, 1998) γX = 4,23. Durch Einsetzen der Kohlenstoffbilanz in die Redoxbilanz kann man den Reduktionsgrad des Kohlenstoffs der Verlustrate berechnen. Der berechnete Wert hängt stark vom angenommenen Reduktionsgrad der Biomasse ab. Mit γX = 4,18 wird γVerlust = 3,3, mit γX = 4 wäre auch

γVerlust = 4. Der Reduktionsgrad γVerlust liegt also leicht unter 4. Es werden Substanzen mit einem ähnlichen Reduktionsgrad wie Glukose, Biomasse oder Proteine verloren, nicht aber stärker reduzierte Stoffe wie Ethanol oder Lipide. 4.3.3 Energiebilanz 4.3.3.1 Nicht-wachstumsgekoppelter Energiebedarf Nach Chmiel (1991) läßt sich der beobachtete Biomasse-Ausbeutekoeffizient Y X S als Funktion des Erhaltungsenergiebedarfs mS′ , des „wahren“ Ausbeutekoeffizienten Y X′ S und der Wachstumsrate beschreiben (s. Gleichung 1 auf S. 12). Von Ingraham et al. (1983) werden die Energiekosten für die Bereitstellung von Bausteinen und die Polymerisation zu den Zell-

112

4. Ergebnisse und Diskussion

bestandteilen ausgerechnet. Es wird - wie auch von Anderson Da Silva und Bailey (1986) vorausgesetzt, daß die zum Einbau eines Mols Kohlenstoff in die Biomasse benötigte Energie von den Umgebungsbedingungen (insbesondere der Temperatur) unabhängig sei. Dies wird experimentell von Wallace und Holms (1986) und Bhattacharya und Dubey (1995) bestätigt. Der wahre Ausbeutekoeffizient sei also konstant. Der Erhaltungsenergiebedarf mS′ hängt stark von der Temperatur ab (Wallace und Holms, 1986). Er sei bei 30°C gegenüber der zum Wachstum verbrauchten Energie vernachlässigbar. In der Fed-Batch-Phase I ist dann die Biomasse-Bildung die einzige Energiesenke. Damit entspricht der beobachtete Ausbeutekoeffizient dem „wahren“ Ausbeutekoeffizienten, Y X′ S = 0,58 mol mol-1. Der Kohlendioxidausbeutekoeffizient war YCO2 S = 0,42 mol mol-1.

8

-1

mS /mmol g h

-1

6

4

2

0

-2 -5

0

5

10

tind /h

Abb. 36: Nicht-wachstumsgekoppelter Energiebedarf als zu veratmende Glukose in Mol Kohlenstoff pro Biomasse und Zeit. Nach Gleichung 20 mit einem „wahren“ Ausbeutekoeffizienten von Y’X/S = 0,58 mol mol-1 berechnet. Durchgezogene Linie: Standardkultivierungen, gepunktete Linie: Kontrollkultivierungen. Es wird hier unterschieden zwischen dem Erhaltungsenergiebedarf m′S und dem nichtwachstumsgekoppelten

Energiebedarf

mS.

Bei

letzteren

sollen

alle

nicht-

wachstumsgekoppelte Energiesenken enthalten sein, auch solche, die nur in rekombinanten Mikroorganismen auftreten (besonders Expression Plasmid-kodierter Gene). Beide werden in mmol g-1 h-1 (Kohlenstoff im Substrat pro Biomasse und Zeit, der in Kohlendioxid umgesetzt

4.3. Online verfügbare Informationen zu Wachstum und Stoffwechsel

113

wird) angegeben. Der nicht-wachstumsgekoppelte Energiebedarf mS läßt sich nach Umformen der von Chmiel (1991) gegebenen Gleichung berechnen nach mS =

q X ⋅ (YX′ S − YX S ) . Y X′ S ⋅ YX S

(20)

Unmittelbar nach dem Temperatursprung erreichte mS in Kontroll- und Standardkultivierung einen Wert von 2 mmol g-1 h-1 (Kohlenstoff pro Biomasse und Zeit) oder 0,06 g g-1 h-1 an Glukose, die zur Energiegewinnung veratmet werden muß (Abb. 36). Wallace und Holms (1986) geben für den Erhaltungsenergiebedarf bei 40°C einen Wert von 0,05 g g-1 h-1 an. Danach stieg mS in den Standardkultivierung schnell auf 6 mmol g-1 h-1 weiter. In den Kontrollkultivierungen wurde diese Schwelle nach allmählicher Steigung erst neun Stunden nach dem Temperatursprung überschritten. Der nicht-wachstumsgekoppelte Energiebedarf beanspruchte unmittelbar nach dem Temperatursprung 40%, bald aber 80% der zugefütterten Glukose. Drei Interpretationen für seine Ursachen sollen im folgenden diskutiert werden. Bei steigender Temperatur erhöht sich der Erhaltungsenergiebedarf ( mS′ >> 0); daneben kann als Energiesenke auftreten:

(

−1 1 a) Verlust von Verbindungen, deren Synthese energieaufwendig ist YVerlust/CO > YX−/CO 2 2

(

30° C b) weniger effiziente Energieproduktion YATP CO 2 < YATP CO 2

)

)

c) oder Um- statt Aufbau der Biomasse, also Synthese von Stoffen, die nicht direkt zum Wachstum der Zellen beitragen. 4.3.3.2 Verlust energiereicher Substanzen? Die Energiebilanz wird unter der vereinfachenden Annahme aufgestellt, daß jedes Molekül Glukose die Glykolyse durchlaufe. Bei Pyruvat teilen sich die Ströme: ein Teil wird zum Aufbau der Biomasse verwendet, ein anderer Teil wird decarboxyliert, tritt als Acetyl-CoA in den Tricarbonsäurezyklus (TCA) ein und wird zur Energiegewinnung veratmet. Die Kohlendioxidbildung ist somit ein Maß für den Energiegewinn. Die Energiebilanz erhält damit die Form88 qCO 2 = mS′ +

88

qX YX

CO2

+

q Verlust YVerlust CO2

.

(21)

Es werden Energiebereitstellung und –verbrauch gleichgesetzt; Akkumulation wird nicht berücksichtigt. Zwar sank der AEC in Standard- und Kontrollkultivierung nach dem Temperatursprung um etwa 10% (A. Kaiser bzw. J. Weber; unveröffentlicht), wegen der mit etwa 10 µmol g-1 nur geringen spezifischen Konzentration an Adenylat-Nukleotiden ist diese Akkumulation aber gegen die Bildungs- und Verbrauchsströme zu vernachlässigen.

114

4. Ergebnisse und Diskussion

Der Biomasse-Ausbeutekoeffizient (bezogen auf den zur Energiegewinnung zu Kohlendioxid oxidierten Substrat-Kohlenstoff) hat in der Fed-Batch-Phase I den Wert

YX

CO2

=

YX S qX = = 1,38 mol mol −1 . qCO 2 YCO2 S

Pro Mol in die Biomasse eingebauten Kohlenstoffs müssen 1 Y X

(22)

CO 2

= 0,724 mol Kohlenstoff

aus Glukose zu Kohlendioxid veratmet werden. Nach dem Temperatursprung zeigte der nicht-wachstumgekoppelte Energieverbrauch (Abb. 36) neben einem „Basalwert“ für alle Kultivierungen einen Verlauf, der der Verlustrate qVerlust (Abb. 35) ähnelt. Man kann den nicht-wachstumsgekoppelten Energiebedarf mS in einen Temperatur-abhängigen Teil (Erhaltungsenergiebedarf

m′S ) und einen Verlust-

verursachten Teil qVerlust YVerlust CO 2 aufteilen (s. Gleichung 21), die nach dem Temperatursprung neben der Biomasse als Energiesenke auftreten. Der Ausbeutekoeffizient YVerlust CO 2 wird so bestimmt, daß m′S konstant bleibt. Er beträgt ein Drittel von Y X

CO 2

, also

YVerlust CO 2 = 0,456 mol mol-1 (nicht wiedergefundener Kohlenstoff pro zu Kohlendioxid oxidierter Kohlenstoff aus Glukose). Damit wäre m′S (42°) ≈ 2,0 mmol g-1 h-1 (Kohlendioxid pro Biomasse und Zeit). In diesem Parameter sind alle Biomasse-, nicht Wachstums-abhängigen Energie-verbrauchenden Prozesse zusammengefaßt wie der Turnover von Proteinen, aber auch Futile Cycling oder der Verlust von Protonen durch die Zellmembran. Außerdem werden unter großem Energieaufwand hergestellte Substanzen (drei Mal so energiereich wie Biomasse) in den Kulturüberstand verloren. Diese Parameter beschreiben die Meßwerte für den nicht-wachstumsgekoppelten Energiebedarf (Abb. 36) aller Kultivierungen, sowohl von Standard- als auch Kontrollkultivierungen. Bei den verlorenen energiereichen Substanzen kann es sich – wie die Redoxbilanz zeigte – nicht um Fettsäuren handeln. Obwohl berichtet wird, daß Bakterien in der stationären Phase NAD ausscheiden (Terpstra und Witholt, 1983), und auch in den hier beschriebenen Kultivierungen im Kulturüberstand Substanzen, die bei den gleichen Wellenlängen wie NADH und Riboflavin fluoreszieren (s. 4.3.4), gefunden wurden, kannn es sich, wie im angegebenen Absatz diskutiert, nicht um die genannten Substanzen handeln. Wegen der Vielzahl der bei hoher Zelldichte in den Überstand abgegebenen Substanzen (erkennbar z. B. an der zunehmenden Absorption des Überstandes), die die Quantifizierung ein-

4.3. Online verfügbare Informationen zu Wachstum und Stoffwechsel

115

zelner Komponenten erschweren89, scheint eine Isolierung und Charakterisierung einzelner Stoffe im günstigsten Falle schwierig. Die bereits identifizierten Substanzen im Überstand (Proteine, Glutamat, geringe Mengen organischer Säuren, Nukleobasen und cAMP) summieren sich nicht zu der berechneten Verlustrate auf. Damit ihre Biosynthese als Energiesenke auftreten kann, müßten sie in hohen Mengen nachsynthetisiert werden. Eine entsprechende Induktion biosynthetischer Enzyme wurde nicht beobachtet. Diese Interpretation des nichtwachstumsgekoppelten Energieverbrauchs alleine ist also nicht geeignet, die Beobachtungen zu erklären. 4.3.3.3 Verringerte Effizienz der Energieproduktion? Der ATP-Umsatz ist sehr schnell und keiner direkten Messung zugänglich. Es ist experimentell nicht zu unterscheiden, ob nach dem Temperatursprung mehr Energie verbraucht wird oder ob die verstärkte Dissimilation der Glukose zur Kompensation einer verringerten Effizienz der Energieproduktion erfolgt. Die Ausbeute an ATP bezogen auf das gebildete Kohlendioxid ergibt sich aus der Bilanz der Glykolyse und des TCA: YATP/CO 2 ≈ 2 ⋅

P 1 + mol mol −1 . O 3

(23)

Eine geringere Energieproduktion kann bedeuten, a) daß Stoffwechselwege mit geringerer Energieausbeute benutzt werden (weniger Substratgekoppelte Phosphorylierung; YATP/CO 2 − 2 ⋅

P 1 < mol mol −1 ), O 3

b) daß NADH nicht vollständig zu NAD+ regeneriert wird und akkumuliert, c) oder daß das P/O-Verhältnis90 kleiner wird (weniger Atmungsketten-Phosphorylierung). Es ist nicht auszuschließen – obwohl es auch keinen konkreten Anhaltspunkt gibt –, daß neben der Glykolyse weniger energieeffiziente Reaktionsfolgen zum Abbau der Glukose benutzt werden. Da aber durch Substrat-gekoppelte Phosphorylierung nur ein sehr geringer Teil des ATP regeneriert wird91, können weniger effiziente Stoffwechselwege den beobachteten „Erhaltungsenergiebedarf“ von über 70% der zugefütterten Glukose nicht erklären.

89

Beispielsweise stimmen die mit FIA oder mit HPLC bestimmten Glutamat-Konzentrationen überhaupt nicht überein, da in der FIA ein sehr hohes Hintergrundsignal gemessen wird (T. Richter, persönliche Mitteilung); die Bestimmung von Methylglyoxal ist nicht möglich, da ein großer Peak unbekannter Substanzen das ganze Chromatogramm überdeckt (A. Kayser, persönliche Mitteilung) 90 P/O-Verhältnis…gebildete energiereiche Phosphatbindungen pro reduziertes Sauerstoffatome 91 Gilt der in der Literatur angegebenen Maximalwert von P/O = 2, macht die Substrat-gekoppelte Phosphorylierung weniger als 10% der ATP-Regeneration aus.

116

4. Ergebnisse und Diskussion

Indirekte Hinweise lassen eine Akkumulation von NADH möglich erscheinen: 1) In Kultivierungen, in denen nach dem Temperatursprung Glukose schneller zugefüttert wurde als in der Standardkultivierung, akkumulierten zunächst Glutamat, später Pyruvat und Laktat, zuletzt auch Alanin im zellfreien Kulturüberstand (nicht gezeigt). Dies kann dafür sprechen, daß αKetoglutarat und Pyruvat nicht effektiv metabolisiert werden und zu Glutamat bzw. Alanin transaminiert bzw. zu Laktat reduziert werden. Die einschlägigen Enzyme (α-Ketoglutaratund Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexe) werden durch NADH inhibiert. 2) Die online gemessene Kulturfluoreszenz, die bei den Wellenlängen gemessen wird, bei denen NADH maximal fluoresziert, stieg in Standardkultivierungen nach dem Temperatursprung steiler als in Kontrollkultivierung (s. 4.3.4). Allerdings zeigten direkte Messungen des Verhältnisses von reduzierten zu oxidierten Nukleotiden (CRC für catabolic reduction charge) in den hier beschriebenen Hochzelldichtekultivierungen von E. coli keine Akkumulation von NADH (J. Weber, unveröffentlicht). Allgemein scheint der CRC in E. coli einer strikten Kontrolle zu unterliegen: in Hefe ändert sich der CRC in Antwort auf Veränderungen der Umgebungsbedingungen stark, unter den gleichen Versuchsbedingungen variiert der CRC in E. coli kaum (Unkefer und London, 1984). Eine Akkumulation von NADH kann also den beobachteten nicht-wachstumsgekoppelten Energiebedarf nicht erklären. Um ein eventuell verringertes P/O-Verhältnis zu bestimmen kann man annehmen, daß dafür die Temperatur und/oder die Kohlenstoff-Verlustrate verantwortlich sei. Die dann scheinbaren Energiesenken fallen aus der Energiebilanz heraus. Man kann für diese Fälle das Verhältnis des aktuellen zum maximalen Ausbeutekoeffizienten YATP CO 2 ausrechnen, das dann die Energiebilanz schließt. Es entspricht etwa dem Verhältnis des aktuellen zum maximalen P/OVerhältnis:

YATP CO2 YATP CO2, max

mS′ + =

qX YX CO2

+

q CO 2

q Verlust YVerlust CO2

.

(24)

Der Erhaltungsenergiebedarf mS′ und der Verlust-verursachte Energiebedarf machen jeweils etwa die Hälfte des Energieverbrauchs aus. Sollte einer dieser beiden Faktoren einen scheinbaren Energiebedarf darstellen, d. h. auf einer verringerten Effizienz der Energiesynthese beruhen, fiele das Verhältnis nach Gleichung 24 nach dem Temperatursprung auf 0,5. Im Falle der Kontrollkultivierung stieg der Verlust-verursachte Energiebedarf mit der Zeit. Sollte die-

4.3. Online verfügbare Informationen zu Wachstum und Stoffwechsel

117

ser einen scheinbaren Energiebedarf darstellen, fiele das Verhältnis nach Gleichung 24 etwa linear von eins auf 0,5 innerhalb von zehn Stunden nach dem Temperatursprung. Die verringerte Effizienz der Atmungskette erklären Neijssel und Teixeira de Mattos (1994). Es gibt in der Atmungskette von E. coli zwei terminale Oxidasen, die Cyt-o-Oxidase mit geringer Affinität zum Sauerstoff, die zwei Protonen pro zwei Elektronen nach außen transportiert, und die bei kleinen Sauerstoffkonzentrationen dereprimierte Cyt-d-Oxidase, die eine hohe Affinität zum Sauerstoff hat, aber nur ein Proton transportiert. Angewendet auf die vorliegenden Daten müßte man postulieren, daß nach dem Temperatursprung trotz konstanten Sauerstoffpartialdrucks die Sauerstoffkonzentration an der Zelloberfläche so klein ist, daß ein erheblicher Teil des Elektronentransports über die Cyt-d-Oxidase abläuft. Dies wäre eine von der Temperatur, die geringere Sauerstofflöslichkeit verursacht, bedingte Verringerung der Energiegewinnungseffizienz. Daneben gibt es zwei NADH-Dehydrogenasen, wovon nur die NDH-1 mit Protonentranslokation verbunden ist. Die NDH-2 dient zur Reoxidation von NADH, wenn große Flüsse durch die Glykolyse aufrechterhalten werden müssen (Neijssel und Teixeira de Mattos, 1994). Wenn nach dem Temperatursprung großer Bedarf an Aminosäuren zur Synthese nichtwachstumsfördernder Proteine besteht92, müssen die Ströme durch die Glykolyse und den Tricarbonsäurezyklus erhöht werden. Dabei fällt möglicherweise mehr NADH an, als zur Energiegewinnung benötigt wird oder über die NDH-1 reoxidiert werden kann. Die erzwungene Synthese nicht-wachstumsfördernder Proteine führt also zu geringerer Effizienz in der Energiegewinnung. Verringerte Energiegewinnungseffizienz und Verlustrate wären dann nicht ursächlich miteinander verbunden, sondern zwei Folgen der Produktion nichtwachstumsfördernder Proteine, die z. T. in der unlöslichen Zellfraktion anfallen93. 4.3.3.4 Produktion nicht-wachstumsfördernder Proteine? Die Produktion nicht-wachstumsfördernder Proteine (nwf) selbst kann als Energiesenke aufgefaßt werden. Unter der Annahme, der Energiebedarf der Proteinsynthese sei dem der Biomasse-Bildung vergleichbar94 ( Ynwf

92

CO 2

≈ YX CO 2 nach Gleichung 22) und der Erhaltungsener-

In der Standardkultivierung durch die Induktion von bFGF (und der Hitzeschockproteine) verursacht. In der Kontrollkultivierung stiegen die Bildungsgeschwindigkeiten konstitutiv synthetisierter Plasmid-kodierter Proteine (Repressor cI und β-Laktamase) mit der Zeit an und verursachten den postulierten erhöhten AminosäureBedarf. 93 Daß die in aggregierter Form anfallenden Proteine die Verlustrate bedingen können, wird auf S. 95 diskutiert. 94 Der theoretische Energiebedarf zur Biomasse-Bildung beträgt YATP/X = 34,7 mmol g-1 (Anderson Da Silva und Bailey, 1986). Für die Synthese des Proteins in einem Gramm Biomasse (also für 550 mg an Protein, Ingraham et al., 1983) werden 22 mmol an ATP benötigt (Ingraham et al., 1983). Der theoretische Energiebedarf zur Proteinbildung beträgt somit YATP/Protein = 40 mmol g-1.

118

4. Ergebnisse und Diskussion

giebedarf betrage wie oben bestimmt mS′ = 2 mmol g-1 h-1, kann man die Bildungsgeschwindigkeit nicht-wachstumsfördernder Proteine qnwf durch Umformen von Gleichung 21 bestimmen nach

q nwf = Ynwf

CO 2

  qX ⋅  q CO 2 − − mS′    YX CO 2  

(25)

und mit dem Proteingehalt der Biomasse von 550 mg g-1 (bzw. 0,55 mol mol-1, da die Kohlenstoffanteile von Proteinen und Biomasse etwa gleich sind) dann den Anteil %Pnwf nichtwachstumsfördernder Proteine an der Gesamtproteinsynthese nach % Pnwf =

q nwf

q nwf ⋅ 100% . + 0,55 ⋅ q X

(26)

Dieser Anteil ist in Abb. 37 mit den Meßdaten aus 2D-Gelen (s. 4.2.8) verglichen.

100

Anteil /%

80

60

40

20

0 0

2

4

6

8

tind /h

Abb. 37: Anteil nicht-wachstumsfördernder Proteine an der Gesamtproteinsynthese Linien: aus online Daten nach Gleichung 26 errechnet und gefiltert (gestrichelt: Kontrollkultivierungen, durchgezogen: Standardkultivierungen); Symbole: aus 2D-Gelen bestimmt (Quadrate: Standardkultivierung, andere: Kontrollkultivierung, Details s. Legende zu Abb. 33 auf S. 105). Obwohl die online Daten besonders unmittelbar nach dem Temperatursprung wegen der zu diesem Zeitpunkt veränderten Zufütterungsrate ungenau sind und insgesamt Schwankungen

4.3. Online verfügbare Informationen zu Wachstum und Stoffwechsel

119

aufweisen, zeigen sie qualitativ den gleichen Trend wie die Meßdaten aus 2D-Gelen. Insbesondere wird der anhaltend hohe Anteil nicht-wachstumsfördernder Proteine in der Standardkultivierung gut sichtbar. Durch die Korrelation der Atmungsraten mit dem Energieverbrauch für die Synthese nicht-wachstumsfördernder Proteine wird der „seltsame“ Verlauf der Atmungsraten in der Kontrollkultivierung (steiler Anstieg nach dem Temperatursprung, baldiger Abfall, allmählicher Wiederanstieg) verständlich: die nicht-wachstumsfördernden Proteine sind in der Kontrollkultivierung aus zwei Gruppen von Proteinen zusammengesetzt: die Hitzeschockproteine werden unmittelbar nach dem Temperatursprung mit hoher Bildungsgeschwindigkeit für kurze Zeit synthetisiert, während die Bildungsgeschwindigkeiten konstitutiv synthetisierter Plasmid-kodierter Proteine in einem „autokatalytischen“ Prozeß immer schneller ansteigen. Die Überlagerung dieser beiden Verläufe bedingt die Atmungsraten in der Kontrollkultivierung. Der Anteil nicht-wachstumsfördernder Proteine an der Gesamtproteinsynthese läßt sich aus den gemessenen Ausbeutekoeffizienten berechnen. Umgekehrt bestimmt Stouthammer (1973) den maximalen Ausbeutekoeffizienten YX/ATP aus der Zusammensetzung von E. coli und dem bekannten Energieverbrauch zur Synthese und zur Polymerisation der Bestandteile. Anderson Da Silva und Bailey (1986) übertrugen diesen Ansatz auf rekombinante Bakterien. Der Plasmidmassenanteil hat einen sehr geringen Einfluß auf den Ausbeutekoeffizienten. Bei der Berechnung des Einflusses des rekombinanten Proteins muß man entscheiden, ob das Protein zur Biomasse beiträgt95. Der Ansatz von Anderson Da Silva und Bailey (1986) wurde erweitert, indem die Stoffwechsellast nicht nur für das rekombinante Protein, sondern für alle nicht-wachstumsfördernde Proteine berücksichtigt wurden, wie in 4.2.8 ausführlich diskutiert. Mit den Gleichungen aus Anderson Da Silva und Bailey (1986)

wurde YX/ATP

für

einen Anteil nicht-

wachstumsfördernder Proteine an der Gesamtproteinsynthese von 80% berechnet. Tragen diese Proteine zur Biomasse bei, ist das Verhältnis des maximalen Ausbeutekoeffizienten zu dem maximalen Ausbeutekoeffizienten des Wirts ohne Plasmid 83%; werden diese Proteine verloren oder abgebaut (im letzteren Falle werden die Aminosäuren wiederverwertet), beträgt das Verhältnis nur 26,8% bzw. 28%. Mit dem „wahren“ Ausbeutekoeffizienten Y X′ S = 0,58 mol mol-1, dem errechneten Verhältnis der maximalen Ausbeutekoeffizienten, der Wachstumsrate von 0,05 h-1 und einem Erhaltungsenergiebedarf von 2 mmol g-1 h-1 bei 42°C

95

Anderson Da Silva und Bailey (1986) führen die entsprechenden Berechnungen für sekretiertes Protein durch. Auch wenn ein Großteil der nicht-wachstumsfördernden Proteine abgebaut würde, trügen diese Proteine nicht zur Biomasse bei.

120

4. Ergebnisse und Diskussion

berechnet man den beobachteten Ausbeutekoeffizienten Y X S zu 0,31 mol mol-1 bzw. 0,13 mol mol-1. Der Mittelwert des Ausbeutekoeffizienten Y X S

der Standardkultivierungen lag bei

0,2 mol mol-1. Die beobachtete Wachstumsrate läßt sich also quantitativ durch die Synthese nicht-wachstumsfördernder Proteine, von denen ein Teil abgebaut wird, erklären. Andere Effekte der Plasmidpräsenz und der Expression der kodierten Proteine (Veränderungen des RNA-Stoffwechsels, Verlust periplasmatischer Proteine) treten dagegen in den Hintergrund. Der physiologische Zustand des Wirtsbakteriums läßt sich adäquat mit dem für nichtwachstumsfördernde Proteine verbrauchten Anteil der zugefütterten Glukose beschreiben. Der „wahre“ Ausbeutekoeffizient und der Energiebedarf für die Synthese aktiver Biomasse änderten sich nicht. Die Synthese nicht-wachstumsfördernder Proteine läßt sich damit auch dem Erhaltungsenergiebedarf zuschlagen. So fanden Bhattacharya und Dubey (1995), daß sich bei der Synthese eines rekombinanten Proteins der „wahre“ Ausbeutekoeffizient nicht änderte, der scheinbare Erhaltungsenergiebedarf aber stark anstieg. Von den drei vorgeschlagenen Interpretationen für den verstärkten Katabolismus nach dem Temperatursprung (Verlust energiereicher Substanzen, verringerte Effizienz der Atmungskette und Synthese nicht-wachstumsfördernder Proteine) wird auch wegen der guten Übereinstimmung in Abb. 37 der letzteren der Vorzug gegeben. Es soll dabei betont werden, daß sich die drei Interpretationen nicht gegenseitig ausschließen, sondern im Gegenteil z. T. ineinander überführbar

sind.

Es

ist

wie

diskutiert

vorstellbar,

daß

die

Synthese

nicht-

wachstumsfördernder Proteine durch den erhöhten Bedarf an Aminosäuren den Fluß durch den Tricarbonsäurezyklus so steigert, daß zur Regeneration des entstehenden NADHs die nicht mit Protonentranslokation verbundene NDH-II benutzt wird, wodurch das P/OVerhältnis kleiner wird. Da die nicht-wachstumsfördernden Proteine, besonders bFGF, aber auch der Repressor cI z. T. in aggregierter Form vorliegen, können sie auch für den Verlust von Substanzen in den Kulturüberstand verantwortlich sein. 4.3.4 Überwachung des physiologischen Zustands mit online Meßgrößen Im zellfreien Kulturüberstand ließen sich Proteine nachweisen. Soweit sie identifiziert sind, handelte es sich um periplasmatische Proteine und um solche, die mit der Membran assoziiert sind und z. B. durch osmotische Schockbehandlung freigesetzt werden können, wie beispielsweise DnaK (el Yaagoubi et al., 1994). Schon in der Fed-Batch-Phase I fanden sich geringe Mengen an Proteinen im Kulturüberstand, allerdings stieg die Ausscheidungsrate nach dem Temperatursprung stark an. Die im zellfreien Kulturüberstand gefundenen Proteine ent-

4.3. Online verfügbare Informationen zu Wachstum und Stoffwechsel

121

sprechen 30% des periplasmatischen Proteins (oder dem periplasmatischen Protein von 30% der Bakterien, vgl. Abb. 28 auf Seite 94)96. Daneben akkumulierte die Aminosäure Glutamat, von der bekannt ist, daß Zellen sie als Reaktion auf Streß verlieren, mit einer ähnlichen Kinetik im Medium. Weitere Aminosäuren wurden nicht in nennenswerten Mengen gefunden. Der Verlust von Proteinen und anderen Substanzen wird als unspezifische Antwort auf Streß angesehen (Roshchina und Petrov, 1997). Die Mengen der bisher identifizierten Substanzen im Medium sind deutlich geringer als die Kohlenstoff-Verlustrate (s. 4.3.1.2). Sie akkumulieren aber mit ähnlichen Zeitverläufen. Die online meßbare Verlustrate wäre demnach als Streßindikator brauchbar. Die Fluoreszenz der Kulturbrühe97 wies in der Batch- und Fed-Batch-Phase I den gleichen Verlauf in Standard- und Kontrollkultivierung98 auf. Nach dem Temperatursprung nahm die Fluoreszenz etwa linear zu, und zwar in den Standardkultivierungen mit deutlich größerer Steigung als in den Kontrollkultivierungen. Offline vermessene Fluoreszenzspektren von zellfreien Kulturüberständen wiesen Intensitätsmaxima bei den gleichen Wellenlängenpaaren auf wie die Kultur. Bei anderen Organismen, vor allem Hefen, wird die Kulturfluoreszenz genutzt, um die Biomasse online abzuschätzen oder Informationen über den physiologischen Zustand der Kultur zu gewinnen. Die Interpretation für E. coli ist erschwert: Einerseits ändert sich das Verhältnis von reduzierten zu oxidierten Nukleotiden (NADH zu NAD+) in E. coli kaum, in Hefen dagegen deutlich in Antwort auf Veränderungen in den Umgebungsbedingungen (Unkefer und London, 1984). Andererseits scheidet E. coli Substanzen aus, die das gleiche Emissionsspektrum wie NADH (Hottinger und Bailey, 1991) oder teilweise überlappende Spektren (Konz et al., 1992) aufweisen. Die Autoren schließen, daß die Kulturfluoreszenz keine diagnostische Relevanz für E. coli habe (Hottinger und Bailey, 1991). Die Fluoreszenz erhöhte sich bei den zitierten Experimenten in der stationären Phase. Auch zeigten Walker und Dhurjati (1989), daß sich bei rekombinanten E. coli mit einem Runaway-

96

Bei osmotischem Schock werden 5% des Gesamtproteins einer Zelle freigesetzt, sind also periplasmatische Proteine (Boos und Lucht, 1996). 97 „Kulturfluoreszenz“ gemessen bei einer Wellenlänge von 450 nm während der Anregung bei 360 nm. Bei dieser Wellenlänge fluoresziert NADH. Mit einem 3D-Fluorimeter, das am Institut für Technische Chemie der Universität Hannover entwickelt und von C. Lindemann an unseren Prozeß angekoppelt wurde, wurden weitere Fluoreszenz-Maxima bei den Wellenlängenpaaren 400 nm/500 nm (bei diesen Wellenlängen fluoreszieren Riboflavine) und bei 450 nm/520 – 530 nm gefunden, deren Intensitäten einen ähnlichen Verlauf nahm wie die „Kulturfluoreszenz“. 98 Die Kulturfluoreszenz stieg in der Batch-Phase proportional zur Biomasse an. Nach Beginn der Zufütterung nahm sie für zwei Stunden kaum zu, zeigte dann regelmäßig einen sehr starken Anstieg und erreichte nach weiteren zwei Stunden einen stationären Wert.

122

4. Ergebnisse und Diskussion

Plasmid99 die spezifische Fluoreszenz bei 36°C nicht von der des Wirtstammes unterschied und beide Kulturen mit der gleichen Wachstumsrate wuchsen, bei 41°C die rekombinante Kultur aber viel stärker fluoreszierte und deutlich langsamer wuchs (Walker und Dhurjati, 1989). Der Streß, der mit einer geringen Wachstumsrate einhergeht - sowohl bei Eintritt in die stationäre Phase oder bei Produktion eines rekombinanten Proteins - scheint die Exkretion der durch Kulturfluoreszenz gemessenen Substanzen hervorzurufen. Während die Verlustrate mit der Anhäufung von Proteinen im Medium korreliert ist, werden bei der Kulturfluoreszenz Substanzen gemessen, die bei Energiemangel in die Umgebung abgegeben werden. Diese Streßfaktoren können durch die Streßindikatoren „Verlustrate“ und „spezifische Fluoreszenz“ verfolgt werden. Ein Ziel bei der Prozeßoptimierung sollte die Minimierung dieser Streßfaktoren sein. Der wichtigste Parameter, der den physiologischen Zustand der Wirtszelle charakterisiert, ist der Anteil nicht-wachstumsfördernder Proteine an der gesamten Proteinsynthese. Proteinsynthese ist der energieaufwendigste Schritt der Biomasse-Bildung. Nach dem Temperatursprung war sie – in der Kontrollkultivierung vorübergehend, in der Standardkultivierung permanent – gegenüber dem Wert in der Fed-Batch-Phase I erhöht. Um den gesteigerten Energiebedarf befriedigen zu können, wurde ein erheblicher Anteil der zugefütterten Glukose veratmet. Die Kohlendioxidbildungsrate ist ein Maß für die Menge an Substrat, die zur Energiegewinnung veratmet wurde. Mit den bekannten Ausbeutekoeffizienten für Biomasse- und Proteinsynthese läßt sich aus online Meßgrößen der Anteil nicht-wachstumsfördernder Proteine an der gesamten Proteinsynthese online berechnen und zur Prozeßüberwachung verwenden. Maßnahmen, die die volumetrische Produktivität des Prozesses erhöhen sollen, können auf die spezifische Konzentration an löslichem bFGF oder auf die Zelldichte abzielen. Es wurde gezeigt, daß durch schnellere Glukose-Zufütterung nur eine geringe Steigerung der spezifischen bFGF-Konzentration erreicht wurde (s. 4.1.2). Modellsimulationen lassen vermuten, daß bei einer Reduzierung der spezifischen Zufütterungsrate innerhalb eines bestimmen Bereichs die spezifische Konzentration insbesondere des löslichen bFGFs nicht beeinträchtigt würde (s. 4.1.3), da ein Großteil des gebildeten bFGFs ohnehin abgebaut wird. Allerdings würde eine langsamere bFGF-Produktion der Zelle erlauben, angemessene Konzentrationen an Hitzeschockproteinen zu bilden, da unter limitierenden Bedingungen eine Verringerung der bFGF-Bildung Ressourcen für die Synthese von Hitzeschockproteinen freimacht. Dies

99

Runaway-Plasmid… bei steigender Temperatur erhöht sich die Plasmidkopienzahl, wodurch die Synthese Plasmid-kodierter Proteine verstärkt wird

4.3. Online verfügbare Informationen zu Wachstum und Stoffwechsel

123

könnte erstens zu einer Stabilisierung des bFGFs und zu höheren spezifischen Konzentrationen führen, und zweitens das Abklingen der Hitzeschockantwort erlauben. Dies ginge mit einer

Reduktion

der

Bildungsgeschwindigkeiten

nicht-wachstumsfördernder

(Hitze-

schock)Proteine einher, die sich online über die Atmungsraten verfolgen läßt. Das Abklingen der Hitzeschockantwort zeigt außerdem an, daß eine ausreichende Konzentration an freiem DnaK vorliegt. Die Konzentration an freiem DnaK ist der entscheidende Einflußfaktor des physiologischen Zustandes des Bakteriums auf die Produktqualität, d. h. die Akkumulation von löslichem bFGF. Gleichzeitig zur Entlastung der Zellen von der Stoffwechsellast der Produktion nicht-wachstumsfördernder Proteine wird die Faltung und Stabilisierung von bFGF verbessert. Auch dieser Effekt

ist

über den Anteil nicht-

wachstumsfördernder Proteine an der Gesamtproteinsynthese abzuschätzen. Die Auswirkungen von Maßnahmen der Prozeßentwicklung auf den physiologischen Zustand, insbesondere das Abklingen der Hitzeschockantwort, und damit auf die Produktqualität lassen sich somit online verfolgen.

124

5. Zusammenfassung und Ausblick

5 Zusammenfassung und Ausblick In Hochzelldichtekultivierungen von E. coli TG1 pλFGFB wurde der humane basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) mit einem Temperatur-induzierbaren Promotorsystem produziert. Nach der Induktion fiel der Biomasse-Ausbeutekoeffizient ab und nahm die Atmungsaktivität zu. Zunächst fand sich bFGF ausschließlich in Einschlußkörpern. Ab vier Stunden nach dem Temperatursprung wurde eine konstante spezifische Konzentration von 45 mg g-1 an bFGF erreicht; davon waren 40% löslich. Höhere spezifische Zufütterungsraten erhöhten die spezifische bFGF-Konzentration nur geringfügig; die spezifische Konzentration löslichen bFGFs wurde gar nicht beeinflußt. Dies wurde durch ein einfaches Modell quantitativ beschrieben. Die Modellparameter für Synthese, Faltung und Degradation von bFGF hingen linear von der Zufütterungsrate bei Induktion ab. Modellsimulationen bestätigten den geringen Einfluß der Zufütterungsrate auf die spezifische bFGF-Konzentration am Kultivierungsende. Der größte Teil des produzierten bFGFs wird abgebaut. In Pulse-Chase-Experimenten aggregierte bFGF teilweise, wenn die Zellen nicht zur Energiegewinnung in der Lage waren. Unter „energiegesättigten“ Bedingungen wurde bFGF hauptsächlich abgebaut. Das Ausmaß dieser beiden Vorgänge war unmittelbar nach Induktion ausgeprägt, zwei Stunden nach dem Temperatursprung aber deutlich reduziert. Die Akkumulation löslichen bFGFs wird durch Aggregation und Degradation limitiert; diese Prozesse hängen vom physiologischen Zustand des Bakteriums ab. Zur Charakterisierung des physiologischen Zustands wurden Protein-Bildungsgeschwindigkeiten und –Konzentrationen in Standardkultivierungen mit TG1 pλFGFB und in Kontrollkultivierungen mit TG1 pCytexP1, der das parentale Plasmid ohne bFGF-Gen trägt, verglichen. Die Bildungsgeschwindigkeiten von Proteinen des Protein-produzierenden Systems – und auch von anderen „Haushaltsproteinen“ - gingen in der Standardkultivierung schnell und deutlich zurück. In der Kontrollkultivierung wurden diese Proteine während der Hitzeschockantwort mit geringer Bildungsgeschwindigkeit hergestellt. Der vorübergehenden Minderproduktion war einem langsamen Rückgang der Bildungsgeschwindigkeiten überlagert. Ein entsprechender Verlauf wurde auch für die Wachstumsraten in den jeweiligen Kultivierungen gefunden. Trotzdem wurde die Gesamtproteinsynthese in der Standardkultivierung dauerhaft um

5. Zusammenfassung und Ausblick

125

den Faktor 2,5 und in der Kontrollkultivierung vorübergehend gesteigert. Die Proteinsynthese limitiert die Akkumulation von bFGF nicht. In der Standardkultivierung verdoppelte sich der Plasmidmassenanteil beim Temperatursprung und blieb danach konstant. Plasmidinstabilität limitiert die bFGF-Produktion nicht. In der Kontrollkultivierung nahm der Plasmidmassenanteil mit fallender Wachstumsrate zu. Die Bildungsgeschwindigkeiten

konstitutiv

synthetisierter

Plasmid-kodierter

Proteine

(β-Laktamase, Repressor cI) stiegen entsprechend und machten am Kultivierungsende 70% der gesamten Proteinsynthese aus. In der Kontrollkultivierung ist die Produktion dieser Proteine für den Abfall der Wachstumsrate verantwortlich. Nach dem Temperatursprung wurde die Synthese von bFGF schnell induziert. Die Bildungsgeschwindigkeit des rekombinanten Proteins belief sich auf mindestens 30% der gesamten Proteinsynthese. Da die insgesamt akkumulierte bFGF-Menge höchstens 8% des Zellproteins betrug, ist die bFGF-Akkumulation nicht durch die Bildungsgeschwindigkeit limitiert. Der Temperatursprung induzierte die Hitzeschockantwort. In der Kontrollkultivierung wurden maximale Bildungsgeschwindigkeiten der Hitzeschockproteine 5 min nach dem Temperatursprung erreicht. Nach einer Stunde waren die Bildungsgeschwindigkeiten fast auf das Vorinduktionsniveau zurückgegangen. In der Standardkultivierung wurden die maximalen Bildungsgeschwindigkeiten erst 30 – 60 min nach Induktion erreicht. Die Konkurrenz mit bFGF um Translationskapazität verzögerte die Hitzeschockprotein-Synthese. Die Hitzeschockantwort konnte nicht abklingen; bis zum Kultivierungsende machten Hitzeschockproteine 40% der gesamten Proteinsynthese in der Standardkultivierung aus. Da die Hitzeschockantwort autoreguliert ist, zeigt dies einen bleibenden Mangel an Chaperonen an. In der Stärke der Hitzeschockantwort unterschieden sich Standard- und Kontrollkultivierung nicht. Eine Ausnahme stellten die kleinen Hitzeschockproteine IbpA und IbpB dar. Sie wurden in der unlöslichen Zellfraktion gefunden und wurden in Standard- und Kontrollkultivierung mit der gleichen Kinetik induziert. Ihre Bildungsgeschwindigkeiten gingen auch in der Standardkultivierung innerhalb einer Stunde auf den Vorinduktionswert zurück. Periplasmatische Proteine wurden nach dem Temperatursprung wie andere Haushaltsproteine mit reduzierter Bildungsgeschwindigkeit synthetisiert. Gleichzeitig verringerten sich ihre intrazellulären Konzentrationen. Sie wurden im Kulturüberstand gefunden.

126

5. Zusammenfassung und Ausblick

Im Gegensatz zu anderen Haushaltsproteinen konnten wichtige metabolische Enzyme nach einer vorübergehenden Minderproduktion auch nach dem Temperatursprung mit der gleichen Bildungsgeschwindigkeit wie in der Fed-Batch-Phase I synthetisiert oder sogar induziert werden. Enzyme des Tricarbonsäurezyklus wurden eine Stunde nach dem Temperatursprung mit fünffacher Geschwindigkeit gebildet. Die Zeitverläufe der Bildungsgeschwindigkeiten waren in Standard- und Kontrollkultivierung gleich. Die Atmungsaktivität stieg in beiden Kultivierungen entsprechend. Die Energiegewinnung scheint auch parallel zur bFGF-Produktion nicht beeinträchtigt zu sein. Nicht für das Zellwachstum benötigte Proteine, d. h. Plasmid-kodierte Proteine (bFGF, β-Laktamase, Repressor cI) und Hitzeschockproteine, die für die Zellerhaltung zuständig sind, machten nach dem Temperatursprung einen großen Teil der gesamten Proteinsynthese aus. In der Standardkultivierung beanspruchten bFGF und Hitzeschockproteine über 80% der zellulären Ressourcen. In der Kontrollkultivierung wurden in der ersten Stunde nach dem Temperatursprung hauptsächlich Hitzeschockproteine, später mit steigendem Plasmidmassenanteil β-Laktamase und der Repressor cI synthetisiert. Diese nicht-wachstumsfördernden Proteine limitieren die Synthese zelleigener Proteine. Bei der Beschreibung des physiologischen Zustands rekombinanter Bakterien mit dem Stoffwechsellast-Konzept muß man beachten, daß auch konstitutiv synthetisierte Plasmid-kodierte Proteine und Hitzeschockproteine Ressourcen verbrauchen. Proteinsynthese ist energieaufwendig und erfordert verstärkten Katabolismus. Während die zugefütterte Glukose in der Fed-Batch-Phase I quantitativ in Biomasse und Kohlendioxid umgesetzt wurde, wurde nach dem Temperatursprung eine „Verlustrate“ als Differenz in der Kohlenstoffbilanz beobachtet, die in der Standardkultivierung schnell einen stationären Wert erreichte und in der Kontrollkultivierung zunächst langsam, dann immer stärker stieg. Einige Substanzen, die als unspezifische Antwort auf Streß ausgeschieden werden, akkumulierten im Kulturüberstand mit der gleichen Kinetik wie die Verlustrate. Aus den Atmungsraten und der Wachstumsrate wurde ein nicht-wachstumsgekoppelter Energiebedarf berechnet. Er ist aus einem Basalwert für den Erhaltungsenergiebedarf von 2 mmol g-1 h-1 an Glukose und einem zeitabhängigen Anteil zusammengesetzt. Aus letzterem ließ sich der Anteil nicht-wachstumsfördernder Proteine an der Gesamtproteinsynthese berechnen. Er stimmt mit den Meßwerten aus 2D-Gelen überein. Die wichtigste Größe, die den physiologischen Zustand produzierender Zellen in Hochzelldichtekultivierungen charakterisiert, ist also online zugänglich.

5. Zusammenfassung und Ausblick

127

Der physiologische Zustand rekombinanter Bakterien in Hochzelldichtekultivierung bei 42°C ist durch die ausgedehnte Synthese von nicht-wachstumsfördernden Proteinen, d. h. von Plasmid-kodierten Proteinen und Hitzeschockproteinen, bestimmt. Sie verhindern zum einen die Synthese zelleigener, wachstumsfördernder Proteine und erfordern zum anderen einen verstärkten Katabolismus zur Deckung des mit der gestiegenen Proteinsynthese verbundenen Energiebedarfs. Daher wachsen die Bakterien langsam und mit kleinem Ausbeutekoeffizienten. Die den physiologischen Zustand charakterisierende Größe, der Anteil nichtwachstumsfördernder Proteine an der Gesamtproteinsynthese, läßt sich online aus Kohlendioxidbildungs- und Wachstumsrate abschätzen. Das rekombinante Protein bFGF wird mit großer Geschwindigkeit synthetisiert. Ohne Chaperone ist es instabil und wird abgebaut; bei Energiemangel in den ersten dreißig Minuten nach Induktion aggregiert es zudem. Die Akkumulation von löslichem bFGF wird durch die unzureichende Chaperon-Konzentration limitiert. Chaperone werden als Teil der Hitzeschockantwort gebildet. Die starke bFGF-Synthese verzögert die Synthese von Hitzeschockproteinen. Dies führt zu einem bleibenden Mangel des Chaperons DnaK, wodurch das Abklingen der Hitzeschockantwort verhindert wird. Hitzeschockproteine stellen neben bFGF den Hauptanteil nicht-wachstumsfördernder Proteine in der Standardkultivierung. Zur Optimierung des Prozesses sollte die bFGF-Bildungsgeschwindigkeit reduziert werden, um ausreichende Akkumulation von Chaperonen zu ermöglichen. Die Coexpression von Chaperonen wird nicht empfohlen, da sie die Stoffwechsellast für den Organismus weiter erhöhen würde. Die bFGF-Bildungsgeschwindigkeit kann durch genetische Methoden, z. B. schwächeren Promotor oder Ribosomen-Bindungsstelle, oder auf verfahrenstechnischem Wege durch kleinere Zufütterungsraten verringert werden. Die Akkumulation löslichen bFGFs könnte damit unterstützt werden. Im letzteren Fall sollte die Zufütterungsrate nach der Induktion gesteigert werden, um die volumetrische Produktivität ohne Einfluß auf die spezifische Bildungsgeschwindigkeit zu erhöhen. Eine andere Alternative sind chemisch-induzierbare Promotorsysteme, bei denen die Temperatur frei gewählt werden kann. Dadurch kann die Aggregation von bFGF weitgehend vermieden werden. Es muß allerdings noch ein Plasmid konstruiert werden, daß auch in Hochzelldichtekultivierungen stabil in den Zellen erhalten wird. Derzeit stellt das Temperaturinduzierbare System eine brauchbare Methode zur Produktion von bFGF in Hochzelldichtekultivierungen dar, die durch die skizzierten Maßnahmen weiter verbessert werden kann.

128

6. Literaturverzeichnis

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144

7. Anhang

7 Anhang 7.1

Ausbeutekoeffizienten

Tabelle 19: Kohlenstoffströme100 und Ausbeutekoeffizienten vor und nach dem Temperatursprung Ströme in mmol g-1 h-1 als Kohlenstoff pro Biomasse und Zeit, Ausbeutekoeffizienten in mol mol-1 auf Kohlenstoffbasis. Angestrebte Werte für qS war in der Fed-Batch-Phase I 8,5 mmol g-1 h-1 und in der Fed-Batch-Phase II 6,2 mmol g-1 h-1. vor dem Temperatursprung nach dem Temperatursprung g) Kult. BM-Faktor qS qX qCO2 YCO2/S YX/S qS qX qCO2 YCO2/S YX/S a) f 58 1,146 8,6 5,04 3,6 0,419 0,586 6,8 0,92 5,2 0,765 0,135 f 82 a) 1,013 7,8 4,56 3,4 0,436 0,584 6,1 1,32 4,4 0,721 0,216 a) f 96 1,163 8,4 5,0 3,4 0,41 0,59 5,9 1,16 4,2 0,72 0,18 f 62 a) 1,200 8,8 4,92 3,9 0,443 0,559 6,5 1,5 4,7 0,72 0,23 b) f 49 1,112 7,5 4,33 3 0,400 0,578 7,3 3,00 4,1 0,562 0,411 b) f 57 1,005 8 4,72 3,3 0,413 0,591 6,6 2,51 4 0,606 0,381 f 83 b) 1,153 8,2 4,61 3,5 0,427 0,562 5,8 2,31 3,64 0,628 0,397 f 75 c) 1,129 8,4 4,97 3,6 0,429 0,591 8,4 1,81 5,6 0,667 0,215 c) f 65 1,082 8,1 4,76 3,75 0,463 0,588 12,6 2,38 8,4 0,667 0,189 e) f) f 72 1,000 7,2 4,50 3 0,417 0,625 d) 0,66 0,3 a) Standardkultivierung b) Kontrollkultivierung c) Kultivierung mit massiver Zufütterung (Zufütterungsrate bei Induktion relativ zu Standardkultivierung: f 75: 1,4fach, f 65: 2fach) d) Stufenweise Erhöhung der Zufütterung; qS: 4,7, 7,7 bzw. 12 mmol g-1 h-1 e) qX: 1,4, 2,3 bzw. 3,16 mmol g-1 h-1 f) qCO2: 3,1, 5,1 bzw. 7,7 mmol g-1 h-1 g ) Während der Fed-Batch-Phase I traten neben Biomasse und Kohlendioxid keine sonstigen Produkte, etwa organische oder Aminosäuren, im Medium auf, die Bilanz qGlukose = qBiomasse + qCO2 sollte aufgehen. Da der Proportionalitätsfaktor zwischen Laugeverbrauch und Biomasse mit Fehlerbreite bekannt ist, außerdem für den Kohlenstoffanteil der Biomasse ein Literaturwert benutzt wurde, wurde zur Korrektur ein „BM-Faktor“ ermittelt, mit dem die Wachstumsrate multipliziert wurde, um die Bilanz für die Fed-Batch-Phase I zu schließen. 7.2 Modell für die Bildung, Faltung und Degradation von bFGF Die Faltung bzw. Aggregation von bFGF wird durch das Modell in Abb. 10 (S. 53) mit dem folgenden Differentialgleichungssystem beschrieben: dI dt

100

= q p − (k N + µ ) ⋅ I − k A ⋅ I n ,

(1)

Zufütterungsmassenstrom und Kohlenstoffbildungsrate wurde online gemessen. Die Biomasse ist proportional zum online gemessenen Verbrauch an zur pH-Regelung zudosierter Lauge; damit sind spezifische Größen und die Wachstumsrate zugänglich. Zur Umrechnung der Wachstumsrate µ in den spezifischen BiomasseBildungsstrom qX wurde aus der in der Literatur (Anderson Da Silva und Bailey, 1986) angegebenen mittleren Zusammensetzung von E. coli ein Kohlenstoffgehalt von 0,42 g g-1 errechnet. Die Elementaranalyse der Biomasse zeigte, daß sich der Kohlenstoffanteil über der Kultivierungszeit nicht wesentlich änderte.

7.2. Modell für die Bildung, Faltung und Degradation von bFGF

145

dN = k N ⋅ I − (k D + µ ) ⋅ N und dt

(2)

dA = kA ⋅ I n − µ ⋅ A . dt

(3)

Als Abkürzung wird k1 = kN+kA+µ und k2 = kD + µ festgelegt. Zur Lösung des Differentialgleichungssystems wurde für die Ordnung der Aggregation n = 1 angesetzt. Die Wachstumsrate wurde als konstant angenommen. Man erhält I = qP ⋅

1 − exp( − k 1 ⋅ t ) k1

(27)

und  k 1 − k 2 e − k 2 t e − k1t kN ⋅ q P ⋅  − + N= k1 − k 2 k2 k1  k1 ⋅ k 2

  1 − e − k 2 t 1 − e − k1t kN  = ⋅ q P ⋅  − k1  k1 − k 2  k2 (28)

  . 

Für A wird eine zu N analoge Gleichung erhalten. Die Gesamtmenge ergibt sich als Summe der Konzentrationen der Konformere. Bei der Parameterbestimmung wurde die Geschwindigkeitskonstante der Aggregation kA deutlich kleiner als 10-3 h-1. Es muß also keine irreversible Aggregation beachtet werden. Die Parameter für das reduzierte Modell (kA = 0 h-1) sind in Tabelle 20 gegeben.

Tabelle 20: Parameterwerte für das Modell in Abb. 10 Die Parameter sind qP (konstante (Brutto-)Bildungsgeschwindigkeit des unlöslichen primären Translationsprodukts I), kN (Faltungsgeschwindigkeitskonstante von I zum nativen bFGF N) und kD (Degradationsgeschwindigkeitskonstante des nativen bFGFs N). Die Aggregationsgeschwindigkeitskonstante war kA = 0 h-1. Außerdem sind gemessene und berechnete Wachstumsraten angegeben.

Zufütterungsrate Standard 1,4fach 2fach a)

in mmol g-1 h-1 b) in mg g-1 h-1 c) in h-1

qS a) 6,9 8,4 12,6

qP a) 1,00 1,37 2,26

qP b) 22,5 30,6 50,8

kN c) 0,81 1,02 1,64

kD c) µ mess c) 1,02 0,03 1,53 0,05 2,34 0,07

µ calc c) 0,048 0,065 0,108