Siderophortransport in Escherichia coli und Salmonella enterica

Siderophortransport in Escherichia coli und Salmonella enterica

Siderophortransport in Escherichia coli und Salmonella enterica Dissertation der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Uni...

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Siderophortransport in Escherichia coli und Salmonella enterica

Dissertation der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

vorgelegt von Dipl. Biol. Silke Isabell Müller-Heinz aus Böblingen

Tübingen 2012

Tag der mündlichen Qualifikation:

03.07.2012

Dekan:

Prof. Dr. Wolfgang Rosenstiel

1. Berichterstatter:

Prof. Dr. Klaus Hantke

2. Berichterstatter:

Prof. Dr. Dr. Volkmar Braun

KEEP RIGHT ON TO THE END OF THE ROAD. -HARRY LAUDER

Danksagung Diese Dissertation wurde betreut von Prof. Dr. Klaus Hantke, am Lehrstuhl für Mikrobiologie in der Abteilung Membranphysiologie von Prof. Dr. Volkmar Braun und später, im Interfakultären Institut für Mikrobiologie und Infektionsmedizin in der Abteilung Organismische Interaktionen von Prof. Dr. Karl Forchhammer an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen. Mein aufrichtiger Dank gilt allen, die mich während der letzten Jahre unterstützt und begleitet haben. Ein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Klaus Hantke für die exzellente fachliche Betreuung meiner Arbeit, sein Interesse an deren Fortschritt sowie die ständige Gesprächsbereitschaft und eine Vielzahl kompetenter fachlicher Tipps und Ratschläge. Bei Herrn Prof. Dr. Dr. Braun möchte ich mich herzlich für die Übernahme des Zweitgutachtens, seine Hilfsbereitschaft und wertvollen Anregungen während der Zeit in der Membranphysiologie bedanken. Bei Frau PD Dr. Iris Maldener und Herr Prof. Dr. Friedrich Götz möchte ich mich für ihre Bereitschaft, als Prüfer in der Disputation zu fungieren, bedanken. Herr Prof. Dr. Forchhammer danke ich für die freundliche Aufnahme und Integrierung in seine neue Arbeitsgruppe und die Bereitstellung eines großzügigen Arbeitsplatzes. Herr Prof. Dr. Wolfgang Wohlleben und Herr Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler danke ich für die Möglichkeit der Nutzung der notwendigen Geräte und Materialien, der French Press, der Fermenter und weiterer Geräte. Bei Andreas Kulik möchte ich mich besonders für die Durchführung der Fermentationen bedanken.

Herrn Prof. Dr. Winkelmann danke ich für die Möglichkeit der Nutzung der HPLC sowie für zahlreiche Ratschläge und Hilfe bei allen HPLC-Problemen. Außerdem bedanke ich mich für die Bereitstellung verschiedener Siderophorproben.

Bei Dr. Kornelius Zeth und Dr. Verena Schünemann bedanke ich mich für die Möglichkeit und Durchführung der ITC-Messungen am Max Planck Institut für Entwicklungsbiologie in Tübingen.

Ein besonderer Dank gilt dem Graduiertenkolleg 685 für Infektionsbiologie der DFG und seinen Mitgliedern für die Finanzierung des dreijährigen Stipendiums sowie die Möglichkeiten von Weiterbildungs- und Seminarteilnahmen, die einen Blick über den eigenen „Forschungstellerrand“ hinaus ermöglicht haben.

Bei allen Mitgliedern der beiden Tübinger Arbeitsgruppen, die mich während der Zeit begleitet haben, möchte ich mich für ihre Kollegialität, ihre Hilfsbereitschaft und das angenehme Arbeitsklima bedanken. Für die gute Zusammenarbeit möchte ich mich besonders bei Frau Dr. Marianne Valdebenito und Yvonne Sauermann bedanken. Die beiden haben mir bei vielen Gelegenheiten mit Rat und Tat zur Seite gestanden, vor allem zu Beginn meiner Doktorarbeit bei der Einführung in die HPLC-Technik und die mikrobiologischen Methoden. Bedanken möchte ich mich außerdem bei Beate Rudo, Dr. Stefanie Krambeer, Dr. Thomas Gwinner, Dr. Klaus Eisele, Dr. Julia Hullmann, Dr. Silke Patzer, Janina Donisi, Christina Herrmann und Claudia Menzel für wertvolle Ratschläge, für all die Kleinigkeiten und Hilfen und viele heitere Momente. Vielen Dank an Helmut Schunack und Michaela Kopp für ihre Unterstützung bei allem rund um die vielen Verwaltungsangelegenheiten und dafür, dass sie immer ein offenes Ohr für mich hatten.

Zu guter Letzt gilt mein herzlichster und größter Dank meiner Familie und meinen Freunden, die mich aus vollem Herzen unterstützt und mir geholfen haben und ohne deren Hilfe sich vieles schwieriger gestaltet hätte. Und J. L. danke ich für sein wunderbares Lächeln jeden Morgen…

Inhaltsverzeichnis

1

EINLEITUNG ......................................................................................................... 1

1.1

Escherichia coli als Modellorganismus .................................................................................................... 1

1.2

Die Bedeutung von Eisen als essentielles Spurenelement........................................................................ 1

1.3

Siderophore und ihre Funktion im bakteriellen Organismus................................................................. 2

1.4

Bakterielle Eisenaufnahme bei Escherichia coli und Salmonella spec. ................................................... 7

1.4.1 Enterobactinaufnahme: Das Fep-System ................................................................................................ 8 1.4.2 Salmochelinaufnahme: Das Iro-System .................................................................................................. 9 1.5

Virulenz und wirtsspezifische Abwehr.................................................................................................... 9

1.6

Das Protein Siderocalin: Struktur und Funktion ..................................................................................10

1.7

Bakterielle Zell-Zell-Kommunikation: Quorum sensing........................................................................12

1.8

Bakterielle Signaltransduktionswege .....................................................................................................12

1.8.1 Zweikomponenten-Histidinkinasesysteme .............................................................................................13 1.8.2 Das System QseBC...............................................................................................................................13 1.8.3 Das Protein YgiW ................................................................................................................................14 1.8.4 Die Wirtshormone Adrenalin und Noradrenalin ....................................................................................14 1.9

Ziele der vorliegenden Arbeit .................................................................................................................15

2

MATERIAL UND METHODEN ............................................................................ 17

2.1

Material ..................................................................................................................................................17

2.1.1 Geräte ..................................................................................................................................................17 2.1.2 Verbrauchs- und Kleinmaterialien .........................................................................................................18 2.1.3 Chemikalien .........................................................................................................................................18 2.1.4 Elektrophoresemarker ...........................................................................................................................19 2.1.5 Enzyme ................................................................................................................................................20 2.1.6 Ready-to-use Kits .................................................................................................................................20 2.1.7 Nähr- und Kulturmedien .......................................................................................................................21 2.1.8 Medienzusätze......................................................................................................................................22 2.1.9 Lösungen und Puffer ............................................................................................................................23 2.1.10 Bakterienstämme und Phagen .............................................................................................................27

Seite | i

2.1.11 Klonierungsvektoren, Plasmide und Plasmidkonstruktionen ................................................................ 29 2.1.12 Synthetische Oligonukleotide (Primer) und Affinitätstags ................................................................... 30 2.1.13 Hardware ........................................................................................................................................... 31 2.1.14 Software und Datenquellen ................................................................................................................. 31 2.2

Methoden................................................................................................................................................ 33

2.2.1 Mikrobiologische Arbeitsmethoden ...................................................................................................... 33 2.2.2 Molekularbiologische Arbeitsmethoden ................................................................................................ 36 2.2.3 Proteinbiochemische Arbeitsmethoden ................................................................................................. 40 2.2.4 Analytische Methoden.......................................................................................................................... 47 2.2.5 Sonstige Methoden ............................................................................................................................... 49 2.2.6 Sicherheit............................................................................................................................................. 50 2.2.7 Statistische Auswertung ....................................................................................................................... 50

3

ERGEBNISSE ..................................................................................................... 51

3.1

Allgemeine Bemerkungen ...................................................................................................................... 51

3.2

Siderophoraufreinigung ......................................................................................................................... 51

3.2.1 Enterobactin und seine Derivate ........................................................................................................... 52 3.2.2 Salmocheline ....................................................................................................................................... 54 3.3

Siderocalin und seine Liganden ............................................................................................................. 56

3.3.1 Produktion und Aufreinigung von Siderocalin ...................................................................................... 56 3.3.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Siderocalin) .................................................................................... 57 3.3.3 HPLC-Analyse von Siderocalin ............................................................................................................ 58 3.3.4 Ligandenkonkurrenzversuch: Enterobactin und Salmochelin ................................................................. 59 3.3.5 Proteinmengenbestimmung von Siderocalin.......................................................................................... 59 3.3.6 Siderophormengenbestimmung via Arnow-Reaktion und HPLC von Siderocalin .................................. 60 3.3.7 Wachstumstests zum Bindungsverhalten von Salmochelin an Siderocalin ............................................. 61 3.3.8 Siderocalin und Desferal®..................................................................................................................... 63 3.3.9 Siderocalin und Dextran ....................................................................................................................... 64 3.3.10 Siderocalin, Adrenalin / Noradrenalin und Transferrin ........................................................................ 64 3.4

Das Zweikomponentensystem QseBC und das Protein YgiW............................................................... 65

3.4.1 Herstellung von LacZ-Operonfusionen ................................................................................................. 66 3.4.1.1

β-Galaktosidase als Reporterenzym für eisenregulierte Gene .................................................. 67

3.4.1.2

Siderophorsysteme: Enterobactin und Salmochelin ................................................................. 69

3.4.1.3

Das Protein YgiW .................................................................................................................. 85

3.4.1.4

β-Galaktosidase-Assays in TY-Medium .................................................................................. 97

3.4.1.5

Vergleich von ΔentC und ΔaroB........................................................................................... 101

3.4.2 Enterobactinproduktion ...................................................................................................................... 103

Seite | ii

3.4.2.1

Eisenarme Bedingungen ....................................................................................................... 104

3.4.2.2

Eisenreiche Bedingungen ..................................................................................................... 105

3.4.3 Analysen von YgiW ........................................................................................................................... 107 3.4.3.1

Produktion und Aufreinigung von YgiW............................................................................... 108

3.4.3.2

Polyacrylamid-Gelelektrophorese (YgiW) ............................................................................ 108

3.4.3.3

HPLC-Analyse von YgiW .................................................................................................... 109

3.4.3.4

Proteinmengen-Bestimmung (YgiW) .................................................................................... 110

3.4.3.5

Arnow-Reaktion (YgiW) ...................................................................................................... 111

3.4.3.6

Isothermal titration calorimetry (YgiW) ............................................................................... 111

3.4.4 Biofilmbildung ................................................................................................................................... 113 3.4.5 Motilität ............................................................................................................................................. 114 3.5

Vergleich verschiedener Wildtyplinien ................................................................................................ 118

4

DISKUSSION..................................................................................................... 123

4.1

Siderophoraufreinigung ....................................................................................................................... 123

4.2

Siderocalin ............................................................................................................................................ 123

4.2.1 Siderocalin bindet Enterobactin und seine Derivate ............................................................................. 124 4.2.2 Siderocalin bindet Salmochelin S4 unter bestimmten Voraussetzungen................................................ 125 4.2.3 Siderocalin bindet kein Yersiniabactin ................................................................................................ 126 4.2.4 Siderocalin hemmt das Wachstum von Escherichia coli K-12.............................................................. 127 4.2.5 Siderocalin beeinflusst das Wachstum von Salmochelinproduzenten nicht ........................................... 127 4.2.6 Desferal® und Dextran entfernen kein Eisen oder Enterobactin aus dem Fe(III)-Siderophor-SiderocalinKomplex ..................................................................................................................................................... 130 4.2.7 Adrenalin und Noradrenalin sind keine Bindungspartner von Siderocalin ............................................ 130 4.3

Das Zweikomponentensystem QseBC und das Protein YgiW ............................................................. 131

4.3.1 Das Zweikomponentensystem nimmt Einfluss auf das Enterobactinsystem .......................................... 132 4.3.2 Die Einflussnahme des Zweikomponentensystems auf das Salmochelinsystem .................................... 134 4.3.3 YgiW bindet Enterobactin und seine Derivate ..................................................................................... 134 4.3.4 Das periplasmatische Protein YgiW spielt eine Rolle im QseBC- und Eisenmetabolismus ................... 135 4.3.5 QseBC und YgiW wirken sich auf Biofilmbildung und Motilität von Escherichia coli aus ................... 136 4.3.6 Arbeitsmodell der Fes-, FepA- und IroN-Regulation durch QseB, QseC und YgiW ............................. 137 4.4

Vergleich von Escherichia coli K-12 Derivaten .................................................................................... 139

4.4.1 Unterschiede zwischen den Escherichia coli K-12 Stämmen MC4100 und MG1655 ............................ 139 4.4.2 Die Proteine RelA und SpoT sind nicht die verantwortlichen Faktoren ................................................ 141 4.5

Ausblick ................................................................................................................................................ 142

Seite | iii

5

ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................... 143

5.1

Kurzfassung ......................................................................................................................................... 143

5.2

Summary .............................................................................................................................................. 144

6

ANHANG ........................................................................................................... 145

6.1

Verzeichnisse ........................................................................................................................................ 145

6.1.1 Abkürzungen ..................................................................................................................................... 145 6.1.2 Abbildungen ...................................................................................................................................... 150 6.1.3 Tabellen ............................................................................................................................................. 157 6.2

Publikationen ....................................................................................................................................... 158

6.3

Literatur ............................................................................................................................................... 159

Seite | iv

1 Einleitung 1.1 Escherichia coli als Modellorganismus Escherichia coli (E. coli) ist ein typischer Vertreter der Familie der Enterobacteriaceae. Es handelt sich hierbei um Gram-negative, kurze stumpfe Stäbchenbakterien (ca. 0,6 x 1-2 µm), unbeweglich oder mit peritricher Begeißelung. Sie sind sowohl zur aeroben Atmung, als auch zur anaeroben Fermentation (fakultativ) befähigt. Im wissenschaftlichen Forschungsbereich hat sich diese Bakterienart als weit verbreiteter und hochfrequent genutzter Modellorganismus etabliert, obwohl sie nur ungefähr 1 % der mikrobiellen Kommensalen in Ileum und Caecum von Warmblütern ausmacht. Diese Darmbakterien sind zwischenzeitlich genetisch sehr gut charakterisiert und zeichnen sich außerdem durch ihre einfache Handhabung, leichte Kultivierung sowie die geringe Virulenz der genutzten Laborstämme und seiner Derivate aus. Zudem existieren mehrere pathogene Stämme (DAEC, EAggEC, EHEC, EIEC, EPEC, ETEC, NMEC, UPEC und weitere), die eine Reihe verschiedener Krankheitsbilder bedingen und so ein Studium von Pathogen-Wirt-Interaktionen ermöglichen. In der Molekularbiologie hat E. coli eine herausragende Rolle. Sein Genom von ca. 4,65 x 106 Basenpaaren wurde relativ früh vollständig sequenziert (Blattner et al., 1997), ebenso gelang Jonathan Beckwith an diesem Organismus 1969 die erste Isolierung eines einzelnen Gens von ca. 5000 existierenden Genen. Die Nutzung von E. coli als Klonierungs- oder Expressionswirt sowie als Modellsystem zur Mutantengewinnung ist inzwischen in der Biologie und in anderen Fächern aus dem Laboralltag nicht mehr wegzudenken. Dabei kommen i. d. R. verschiedene apathogene, etablierte K-12 Stämme zum Einsatz (wie beispielsweise MG1655 oder MC4100), da der ursprünglich isolierte E. coli K-12 nicht mehr existiert.

1.2 Die Bedeutung von Eisen als essentielles Spurenelement Die biologische Bedeutung von Eisen (Fe) wird deutlich in seiner Funktion als essentielles Spurenelement für nahezu alle Lebewesen. Eisen spielt eine wichtige Rolle bei der Blutbildung, ebenso wie beim Sauerstofftransport und seiner Speicherung als zentrales Atom des Cofaktors Häm b im Hämoglobin und Myoglobin und in Cytochromen, der DNA- sowie Aminosäuresynthese (Earhart, 1996).

Seite | 1

1 Einleitung

Im menschlichen Körper findet sich Eisen vorwiegend im Hämoglobin und als Depot-Eisen in Ferritin und Hämosiderin. In geringeren Mengen liegt Eisen vor in Myoglobin, in eisenhaltigen Enzymen und im Serum, wo Transferrin das Transportvehikel darstellt. Eisen zählt als wichtigstes Spurenelement und ist besonders katalytisch wirksam. Eine Besonderheit ist die geringe Löslichkeit seiner Verbindungen (Fe(III)-Komplexe wie Oxidhydrat oder Carbonat) bei neutralem pH-Wert. Die Konzentration an freiem Eisen beträgt in natürlicher Umgebung lediglich ca. 10-9 M (Chipperfield & Ratledge, 2000), im Blutserum von Säugern sogar nur 10-26 M (Otto et al., 1991). Die meisten Mikroorganismen, mit Ausnahme weniger Arten wie Lactobacillus plantarum (Archibald & Duong, 1984) oder Borrelia burgdorferi (Posey & Gherardini, 2000), benötigen für effizientes Wachstum Konzentrationen, die über 10-7 M Fe(III) liegen (Braun, 2007; Ratledge & Dover, 2000). Unter sauren Bedingungen ist Fe(III) besser löslich. Das für bakterielles Wachstum auch verwendbare Fe(II) ist zwar besser löslich, aber unter aeroben Bedingungen nicht stabil. So wird die Verfügbarkeit von Eisen in natürlicher Umgebung, obwohl es eines der häufigsten Elemente auf der Erde ist, oft zu einem wachstumslimitierenden Faktor für bakterielle Populationen.

1.3 Siderophore und ihre Funktion im bakteriellen Organismus Viele Mikroorganismen haben eine Lösung für die natürliche Eisenlimitation, in Form der Produktion von Siderophoren gefunden. Siderophore sind sogenannte Eisenchelatoren (griech. für „Eisenträger“). Es sind inzwischen über 300 solcher natürlicher eisenbindender niedermolekularer (400 Da bis 2000 Da) Chelatoren bekannt (Ratledge, 2007), die von Mikroorganismen produziert und ausgeschieden werden. Bei ausreichendem Eisenangebot liegen nur geringste Mengen der Eisenkomplexbildner vor, in Eisenmangelsituationen hingegen werden Konzentrationen von über 100 mg pro Liter gemessen (Braun, 1991). Sie binden Eisen und werden unter Energieverbrauch als dreiwertige Eisenkomplexe zurück in die Zelle transportiert, wo das Eisen freigesetzt und sofort verstoffwechselt oder gespeichert wird. Die Freisetzung erfolgt dabei durch Reduktion von Fe(III) zu Fe(II). In manchen Fällen wird der Komplexbildner hydrolysiert, bevor das Eisen durch Reduktion aus dem Komplexbildner entfernt werden kann (Hydrolyse von Fe(III)-Enterobactin). Siderophore weisen mit ca. 1023 bis 1050 l/mol bei pH 7 eine höhere Stabilitätskonstante auf, als die natürlichen unlöslichen Eisenkomplexe. Sie können aufgrund ihrer Struktur in drei verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Zum einen die Catecholate, zu denen beispielsweise Enterobactin und Salmochelin gehören (Abbildung 1-1), dann die Gruppe der Hydroxamate mit Aerobactin, Desferrioxamin B (Desferal®) und Ferrichrom Seite | 2

1.3 Siderophore und ihre Funktion im bakteriellen Organismus

als prominente Beispiele und schließlich Citrat sowie Yersiniabactin, als Vertreter der dritten Siderophorgruppe, die Carboxylate und Mischformen beinhaltet (Abbildung 1-2).

Unter den Siderophoren ist Enterobactin der stärkste bekannte Fe(III)-Chelator mit einer Dissoziationskonstante (Kd) von ca. 10-49 M (10-35 unter physiologischen pH Bedingungen) (Harris W. R., 1979). Es ist zusammengesetzt aus drei Einheiten 2,3-Dihydroxybenzoylserin (DHBS) (Abbildung 1-1). Seine Bildung erfolgt mit Hilfe des ent-Genclusters (Elkins & Earhart, 1989; Liu et al., 1990) über Chorisminsäure, die durch die Proteine EntA, EntB und EntC zu 2,3-Dihydroxybenzoesäure (DHB) konvertiert wird. Katalysiert durch EntD, EntE, EntF und EntB wird L-Serin an DHB gekoppelt. Drei solcher Moleküle bilden nach intermolekularer Zyklisierung schließlich Enterobactin. Es wurde 1970 zeitgleich von zwei Arbeitsgruppen in Salmonella typhimurium („Enterobactin“ (Pollack & Neilands, 1970)) und E. coli („Enterochelin“ (O'Brien & Gibson, 1970)) entdeckt. Die Produktion von Enterobactin wurde lange einzig den Gram-negativen Mikroorganismen der Familie der Enterobacteriaceae zugeordnet. Im Jahr 2001 wurde jedoch gezeigt, dass die Enterobactinisolierung aus zwei Gram-positiven Streptomyces-Vertretern gelang (Fiedler et al., 2001).

Salmochelin kann seiner Struktur nach als zweifach glycosyliertes Enterobactin betrachtet werden (Abbildung 1-1). Es wird von allen Serogruppen von Salmonella enterica mit Ausnahme der Subspecies IIIb, von uro- und vogelpathogenen E. coli Stämmen, Shigella dysenteriae und Klebsiella pneumoniae (plasmidcodiert) produziert und wird als potentielle Reaktion auf Abwehrmaßnahmen des Wirtes angesehen. Die Basis des Moleküls bildet 2,3-Dihydroxybenzoylserin mit einem Glucoserest C-glycosidisch an C5 der Catecholstruktur gebunden (Bister et al., 2004). Die Bezeichnung für dieses Molekül, das Monomer von Salmochelin, lautet in früheren Arbeiten Pazifarinsäure (Wawszkiewicz & Schneider, 1975) oder Salmochelin SX (Zhu et al., 2005). Das Dimer wird als S1, das lineare Trimer als S2 und das zyklische, zweifach glycosylierte Trimer („Salmochelin“) als S4 bezeichnet. Es existiert zudem ein Salmochelin-Siliciumkomplex S0; Salmochelin und Enterobactin sind die ersten bekannten Naturstoffe, die stabile Komplexe dieser Art bilden (Schmiederer et al., 2011). Verantwortlich für die Salmochelinproduktion ist das iroBCDEN Gencluster sowie das Enterobactin Biosynthese- und Verwertungssystem. IroB ist eine Glycosyltransferase und somit für den elementaren Unterschied zu Enterobactin verantwortlich. IroC ist ein ABC-Exporter, IroD hat Ähnlichkeit zur Enterobactin Esterase Fes und kann Salmochelin spalten, IroE ist eine

Seite | 3

1 Einleitung

periplasmatische Salmochelinesterase und IroN ist der Salmochelinrezeptor der äußeren Membran sowie ein Adhäsin für die Bindung an Epithelzellen (Sorsa et al., 2003).

Yersiniabactin ist ein Siderophor, das natürlicherweise von Yersinia, aber auch beispielsweise von E. coli Nissle 1917 unter Eisenmangelbedingungen produziert wird (Abbildung 1-2). Das von Yersiniabactin abhängige Eisentransportsystem ist dabei auf einem high-pathogenicity island (HPI) codiert, wobei für neun der Genprodukte eine Funktion bei der Synthese oder dem Transport des Siderophors nachgewiesen wurde (Bobrov et al., 2002). Yersiniabactin wird als Virulenzfaktor betrachtet, der unter Eisenmangel wachstumsfördernd wirkt (Haag et al., 1993). Dies ist abhängig von TonB und Irp65 (iron-repressible outer membrane receptor Irp). Irp65 funktioniert demnach als der Yersiniabactinrezeptor und wird als FyuA bezeichnet (Heesemann et al., 1993).

Enterobactin

Salmochelin S4

Abbildung 1-1: Darstellung der Strukturformeln verschiedener Catecholat-Siderophore: Enterobactin und Salmochelin S4 mit den zwei Glycosylresten (rot markiert) (Hider & Kong, 2010).

Die Kompetenz verschiedene Siderophore und insbesondere ihre Aufnahmesysteme zu produzieren, verleiht diesen Organismen einen Selektionsvorteil und ist oft ein virulenzassoziierter Pathogenitätsfaktor.

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1.3 Siderophore und ihre Funktion im bakteriellen Organismus

Aerobactin (GenomeNet http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bfind_sub?mode=bfind&max_hit=1000&dbkey=all&keywo rds=aerobactin)

Desferrioxamin B (EMBL-EBI European Bioinformatics Institute http://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do?chebiId=CHEBI:4356 )

Fe-Ferrichrom (GenomeNet http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bfind_sub?mode=bfind&max_hit=1000&dbkey=all&keywo rds=ferrichrome)

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1 Einleitung

Yersiniabactin (GenomeNet http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bfind_sub?mode=bfind&max_hit=1000&dbkey=all&keywo rds=yersiniabactin)

Citrat (GenomeNet http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bfind_sub?mode=bfind&max_hit=1000&dbkey=all&keywo rds=citrate) Abbildung 1-2: Darstellung der Strukturformeln verschiedener Siderophore: Aerobactin, Desferrioxamin B und Ferrichrom (Hydroxamate) sowie Yersiniabactin und Citrat (Carboxylate / Mischformen).

Das globale Eisenregulationsprotein ist der Fur-Repressor (ferric uptake regulator), der in vielen Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien gefunden wurde. Das entsprechende Gen fur liegt bei 15,5 Minuten auf dem E. coli Chromosom und reguliert alle unter Eisenkontrolle stehenden bekannten Gene (ca. 70). Wird Eisen von Fur gebunden, agiert das Protein als transkriptionaler Repressor. Deletionen des entsprechenden fur-Gens führen zu konstitutiver Expression der eisenregulierten Gene. Bei Gram-positiven Bakterien mit hohem GC-Gehalt wird die Regulation von Proteinen der IdeR-DtxR-Familie (iron dependent regulatory protein / diphteria toxin repressor / regulator) als Eisenrepressor übernommen (Boland & Meijer, 2000). Die regulierten Gene entsprechen weitgehend den von Fur regulierten (z. B. Siderophorbiosynthesegene oder Gene, die wichtig für die Eisenaufnahme sind). Die Sequenzen der Regulatorproteine sind zwar verschieden, allerdings existieren einige strukturelle Gemeinsamkeiten, wie die Tatsache, dass die aminoterminale Domäne die DNA-Bindestelle mit einem Helix-turn-Helix Motiv enthält oder das Vorhandensein von zwei Metallbindestellen (Hantke, 2001).

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1.4 Bakterielle Eisenaufnahme bei Escherichia coli und Salmonella spec.

1.4 Bakterielle Eisenaufnahme bei Escherichia coli und Salmonella spec. Um bakterielles Wachstum zu gewährleisten, muss genügend Eisen verfügbar sein oder verfügbar gemacht werden. Die Produktion und das Ausschleusen von Siderophoren ist der eine Teil der Maßnahmen der Mikroorganismen. Ein weiterer Teil ist das Ausbilden geeigneter Aufnahmekomplexe mit Rezeptoren für das jeweilige Substrat, das durch die vorhandene Eisenkonzentration reguliert wird. So können auch beladene Fremdsiderophore genutzt werden, ohne eigene Energie für die Produktion dieser Moleküle aufzuwenden. Die entsprechenden Rezeptoren sitzen in der äußeren Membran und binden ihr passendes Siderophor. Allerdings erfolgt diese Bindung nicht immer sehr spezifisch, sondern häufig redundant. Einige erkennen nicht nur eine Art Siderophor, sondern mehrere strukturähnliche Moleküle, bei anderen werden nicht nur Siderophore gebunden, sondern beispielsweise auch Bakteriophagen, Colicine oder Antibiotika. Beispiele für Siderophorrezeptoren und eine Auswahl ihrer Liganden sind: FepA, das Fe-Enterobactin, 2,3-Dihydroxybenzoylserin (DHBS), Fe-Salmochelin und die Colicine B und D (Guterman, 1973; Wayne et al., 1976) bindet, Fiu erkennt DHBS und Dihydroxybenzoat, Cir bindet ebenfalls DHBS und Colicin Ia, IroN erkennt Fe-Salmochelin, aber auch FeEnterobactin, DHBS und Corynebactin, FyuA bindet Fe-Yersiniabactin und Pesticin, FhuA bindet das Fe-Ferrichrom der Pilze, Albomycin, Colicin M und die Phagen T5, T1 und Φ80 und Iut bindet Fe-Aerobactin und Cloacin DF13, um nur eine kurze Auswahl der zahlreichen Rezeptoren zu nennen. Nach Bindung des Komplexes an den spezifischen Kanal erfolgt die energieabhängige Freisetzung mit Hilfe eines transmembranen TonB-Proteinkomplexes, der sich von der Cytoplasmamembran bis zum Kanal erstreckt (Hantke & Braun, 1978). Anschließend erfolgt die Freisetzung des Eisenmoleküls über Hydrolyse oder Reduktion und der sofortige Einbau in Zielmoleküle wie Häm oder FeS-Zentren oder in Fe-Speicherproteine; Denn freies Fe(II) reagiert mit H2O2 und bildet das schädliche OH-Radikal. Infolgedessen darf es nur in geringsten Mengen in der Zelle vorkommen. Die Grundstruktur der Eisen(III)Aufnahmesysteme setzt sich aus einem porinähnlichen Rezeptorprotein, das die äußere Membran durchdringt (β-barrel-Struktur), einem periplasmatischen Bindeprotein und einem ABCTransporter in der Cytoplasmamembran zusammen. Die Energieversorgung für den Transport durch die äußere Membran liefert der TonB-Komplex der cytoplasmatischen Membran, bestehend aus den Proteinen TonB, ExbB und ExbD (1 : 7 : 2), der so die Funktion mehrerer Eisenund Vitamin B12-Transportsysteme wie Fhu, Fec, Fep und BtuB sichert (Bassford et al., 1977; Cadieux & Kadner, 1999; Chimento et al., 2003), aber auch dem Transport der Colicine der Seite | 7

1 Einleitung

B-Gruppe und rezeptorabhängiger infektiöser Bakteriophagen dient (Braun, 1995; Lazdunski et al., 1998). Die Energetisierung funktioniert über den Protonengradienten der Cytoplasmamembran. TonB erstreckt sich bis ins Periplasma und kann so über seinen C-Terminus mit der TonB-Box der äußeren Membranrezeptoren wechselwirken (Kadner, 1990; Pawelek et al., 2006; Postle, 1993; Shultis et al., 2006). Ein korrekt gefaltetes TonB-Protein ist für die Funktion der Energieübertragung auf die äußere Membran essentiell, ExbB und ExbD können von TolQR zum Teil ersetzt werden (Braun & Herrmann, 1993). Der Mechanismus der Energieübertragung auf die Membranrezeptoren ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Zur Diskussion stehen zwei Modelle: Das „Propellermodell“, bei dem postuliert wird, das sich der TonBCTerminus propellerartig dreht, bis er schließlich an den äußeren Membranrezeptor bindet, der N-Terminus aber verankert bleibt (Chang et al., 2001) und das „Shuttlemodell“, das von der Annahme ausgeht, dass sich TonB komplett von der Cytoplasmamembran loslöst (Larsen et al., 2003; Peacock et al., 2006; Postle & Kadner, 2003). Die Energieübertragung erfolgt schließlich über eine Reihe an Konformationsänderungen von TonB (Letain & Postle, 1997). Für E. coli K-12 sind bislang sechs von TonB abhängige Eisentransportsysteme nachgewiesen worden. Dazu zählen die Hydroxamat-Siderophorrezeptoren FhuA (Ferrichrom) (Fecker & Braun, 1983) und FhuE (Coprogen) (Sauer et al., 1987), die Catecholat-Siderophorrezeptoren FepA (Enterobactin), FiuA und CirA (beide für DHB und DHBS) (Lundrigan & Kadner, 1986; Nau & Konisky, 1989) und der Carboxylat-Siderophorrezeptor FecA (Citrat) (Pressler et al., 1988). BtuB, der Vitamin B12 Rezeptor, ist ebenfalls abhängig von TonB (Bassford et al., 1976; Heller & Kadner, 1985). Wie bereits erwähnt, werden einige dieser Transportsysteme als Eintrittspforte von Bakteriophagen (Luria et al., 1943; Matsushiro, 1963) oder für das Einschleusen von Colicinen genutzt (Lazdunski et al., 1998). Diese hochaffinen Transportsysteme finden sich in großer Zahl und weit verbreitet in den verschiedenen Bakterienarten wieder.

1.4.1 Enterobactinaufnahme: Das Fep-System Enterobactin ist ein Catecholat-Siderophor (Raymond et al., 2003) und wird von Enterobakterien produziert. Es wird als Eisen(III)-Komplex von FepA, dem Rezeptor in der äußeren Membran erkannt und gebunden. So gelangt es in den periplasmatischen Raum, wo FepB als Bindeprotein des Systems dient (Sprencel et al., 2000). Die cytoplasmatischen Transmembranproteine FepD und FepG vermitteln den Transport durch die Cytoplasmamembran, katalysiert durch Hydrolyse von ATP von FepC als ATP-Bindeprotein (Raymond et al., 2003). Liegt der Ferri-Enterobactinkomplex im Cytoplasma vor, wird Fe3+ durch hydrolytische Spaltung, Seite | 8

1.5 Virulenz und wirtsspezifische Abwehr

vermittelt von der Enterobactin Esterase Fes, für eine noch unbekannte Reduktase zugänglich, und Fe2+ steht zur weiteren Verwendung zur Verfügung (Brickman & McIntosh, 1992; Greenwood & Luke, 1978; Raymond et al., 2003).

1.4.2 Salmochelinaufnahme: Das Iro-System Salmochelin ist seiner Struktur nach ein zweifach glycosyliertes Enterobactin und reagiert deshalb hydrophiler. Produzenten sind vorwiegend Salmonella, aber auch einige pathogene Bakterienarten (s. o.). Die Biosynthese von Salmochelin verläuft wie bei Enterobactin. In einem weiteren Schritt werden anschließend durch die Glycosyltransferase IroB zwei Zuckerreste übertragen, wie in in vivo (Bister et al., 2004) und in vitro Studien (Fischbach et al., 2005) nachgewiesen wurde. Der Exportmechanismus von Salmochelin S4 in das umgebende Medium wird von IroC katalysiert (Hantke et al., 2003). Nach Komplexbildung mit Fe3+ wird dieser Komplex dann von IroN, dem äußeren Membranrezeptor, erkannt und gebunden (Hantke et al., 2003). Im Periplasma wird der zyklische Tri-Ester, vermutlich von IroE, linearisiert (Lin et al., 2005; Zhu, 2005; Zhu et al., 2005). Der grundsätzliche Aufnahmemechanismus basiert auf dem ABC-Transporter FepBCDG wie auch für Enterobactin. Im Cytoplasma erfolgt vermutlich eine weitere Spaltung von Salmochelin durch IroD in seine Derivate (Dimer, Monomer), und damit erfolgt auch die Freisetzung des eingeführten Eisens (Zhu et al., 2005). Die Abbauprodukte werden wieder sekretiert (Zhu, 2005).

1.5 Virulenz und wirtsspezifische Abwehr Der Kampf um Eisen spielt eine herausragende Rolle in der Auseinandersetzung von Wirt und Bakterien. Derjenige, der den Chelatbildner mit höherer Bindungsstärke aufweist, trägt den großen Vorteil davon. So gehört das Schaffen eines Milieus, das nahezu frei von ungebundenem Eisen ist, zu den natürlichen Abwehrmechanismen höherer Organismen. Der menschliche Organismus reduziert die Serumeisenkonzentration gar aktiv, im Falle einer bakteriellen Infektion (Braun, 1991). Dies geschieht durch eine verminderte Resorption aus dem Darm, eine Erhöhung der Transferrinmenge, eine erhöhte Speicherung von Eisen in Ferritin und eine vermehrte Lactoferrinmenge an den Orten erhöhter Bakterienzahl. Die eisenbindenden Proteine mit hoher Bindungsstärke reduzieren freies Eisen und machen es für die Mikroorganismen nicht mehr bzw. schwer zugänglich. Lactoferrin in Milch, Tränen- und Speichelflüssigkeit ist ein Beispiel, ebenso wie Transferrin im Blutserum. Der menschliche Organismus produziert Seite | 9

1 Einleitung

des Weiteren ein Protein mit Namen Siderocalin, das in der Lage ist, Enterobactin zu binden und diese Eisenquelle für Bakterien zu blockieren. Bakterien hingegen haben ihrerseits Strategien entwickelt, um diesen Mechanismen zu entgehen. Zu der Produktion verschiedener Siderophore und Aufnahmemechanismen (Braun, 2001) kommen strukturelle Veränderungen bereits vorhandener Siderophore wie die Glycosylierung von Enterobactin zu Salmochelin, das infolge dessen von Siderocalin nicht mehr gebunden werden kann (Valdebenito et al., 2007; Strong, 2006). Andere pathogene Mikroorganismen betreiben Hämolyse, um an das Eisen im Hämoglobin der Erythocyten zu gelangen oder besetzen intrazelluläre Nischen bzw. nutzen andere Eisenquellen des Wirtes (Wooldridge & Williams, 1993). Es sind weitere Virulenzfaktoren bekannt, für die eine eisenregulierte Synthese gezeigt werden konnte. Zum einen das Tetanustoxin, das Hämolysin von Clostridium perfringens und Listeria monocytogenes und das Toxin A oder auch die alkalische Protease von Pseudomonas aeruginosa. Diese Toxine werden unter Eisenmangelbedingungen synthetisiert und können den Bakterien Zugang zu den intrazellulären Fe-Depots von Hämoglobin, Ferritin und Hämosiderin via Zellschädigung verschaffen (Braun, 1991).

1.6 Das Protein Siderocalin: Struktur und Funktion In der Literatur sind für Siderocalin verschiedene Namen und Homologe zu finden: neutrophilgelatinase-associated lipocalin (NGAL), neutrophil lipocalin (HNL), human superinducible protein 24 kD (SIP24), Lipocalin 2 (Lcn2); bei der Ratte: neu-related Lipocalin (NRL) oder α2-microglobulin related protein; bei der Maus 24p3 oder Uterocalin (Kjeldsen et al., 2000). Die Auswahl differiert, je nachdem welche Arbeitsgruppe, in welchem Kontext auf dieses Protein gestoßen ist. Es handelt sich hierbei um ein 25 kDa großes Protein der Familie der Lipocaline, zu der eine Reihe an kleinen sekretierten Proteinen gezählt wird, die bei Eukaryoten und zwischenzeitlich auch bei Bakterien nachgewiesen wurden. Charakteristisch ist hierbei deren Fähigkeit kleine hydrophobe Moleküle zu binden, die Bindung an spezifische Rezeptoren der Zelloberfläche und die Ausbildung makromolekularer Komplexe. Humanes Siderocalin findet sich als Monomer, Dimer (Axelsson et al., 1995), Trimer und als Komplex mit humaner neutrophiler Gelatinase (Kjeldsen et al., 1993). Es wird während der frühen Phase von Entzündungsreaktionen in verschiedenen Geweben, die häufig Pathogenen exponiert sind, exkretiert. Es sind viele produzierende Zelltypen bekannt. Einige wichtige sind Endothel- (Liu & Nilsen-Hamilton, 1995) und Epithelzellen (Cowland et al., 2003), Seite | 10

1.6 Das Protein Siderocalin: Struktur und Funktion

Hepatozyten, Makrophagen, aber auch Pneumozyten (Sunil et al., 2007). Siderocalin ist Teil der angeborenen Immunantwort und seine Bildung wird durch bakterielle Infektionen induziert. Nachgewiesen wurde die Induktion beispielsweise durch LPS (Sunil et al., 2007), IGF-1, IL6 und TNF-α (Liu et al., 2003), aber auch Leptin (Shen et al., 2006) und weitere Faktoren. Tolllike Rezeptoren auf Immunzellen stimulieren die Transkription, Translation und Sekretion von Siderocalin. Gespeichert und konstitutiv expremiert wird das Protein vorwiegend in sekundären Granula neutrophiler Granulozyten bis zu seiner Freisetzung (Axelsson et al., 1995; Sevéus et al., 1997). Siderocalinmoleküle binden nach ihrer Exkretion effektiv vorhandenes Apo- und Ferri-Enterobactin und verhindern so den Zugang von potentiellen Pathogenen zu ihrer Eisenquelle bzw. ihren Eisenchelatoren (Goetz et al., 2002) (Abbildung 1-3). Die Bindungsaffinität entspricht dabei nahezu der von FepA, dem regulären Enterobactinrezeptor der Bakterien. Der Siderocalin-Eisen-Enterobactin-Komplex kann von polarisierten Epithelzellen mittels des endocytischen Megalinrezeptors aufgenommen werden (Hvidberg et al., 2005). Es kommt zu einer Wachstumsinhibition der bakteriellen Population. Siderocalin wirkt somit unter Eisenmangelbedingungen bakteriostatisch und unterstützt die weiteren antibakteriellen Maßnahmen des Wirtes (Goetz et al., 2002; Yang et al., 2003). In Experimenten mit Siderocalin Knock-outMäusen wurde gezeigt, dass diese zu 80 % von einer definierten Inokulationsmenge eines klinischen E. coli Stammes (2 x 108 CFU) getötet wurden, die den Wildtypmäusen keinen Schaden zugefügt hat (Flo et al., 2004). Inzwischen wurde für Siderocalin auch die Bindung weiterer hydrophober Eisen-CatecholatSiderophore wie beispielsweise von Carboxymycobactin der Mycobakterien nachgewiesen (Holmes et al., 2005) oder dem Bacillibactin der Bacilli-Spezies (Abergel et al., 2006b).

Abbildung 1-3: Siderocalin komplexiert mit Ferri-2,3-Dihydroxybenzoylserin (links und mittig: Ansicht von der Seite; rechts: Ansicht von oben) (Goetz et al., 2002).

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1 Einleitung

1.7 Bakterielle Zell-Zell-Kommunikation: Quorum sensing Quorum sensing bezeichnet die bakterielle Fähigkeit zur Kommunikation untereinander. Die Zellen einer Population können so Prozesse koordinieren, die zelldichteabhängig sind und damit sowohl ihre Effizienz steigern, als auch angepasst reagieren. Davon beeinflusst sind beispielsweise die Biolumineszenz (Nealson & Hastings, 1979; Nealson & Markovitz, 1970; Nealson et al., 1970), die Sekretion von Antibiotika, Pathogenitätsfaktoren oder Siderophoren, die Kompetenz, die Motilität oder die Ausbildung von Biofilmen (Miller & Bassler, 2001). Bakterien können auf diese Weise „sinnvoll“ auf Signale ihrer Umwelt reagieren und ihre Genexpression entsprechend anpassen. Die Kommunikation funktioniert dabei mit Hilfe von Signalmolekülen, so genannten Autoinduktoren bzw. autoinducern (AI), die hormonähnlich funktionieren. Überschreiten sie eine bestimmte Konzentrationsgrenze, reagieren die einzelnen Bakterien darauf. Der kritische intra- und extrazelluläre Schwellenwert liegt zwischen 10 -6 und 10-9 M. Im Bakterium bindet der AI entweder direkt an den entsprechenden Regulator oder geht einen Umweg über ein Signalsystem, so dass infolge dessen die zelldichteabhängigen Gene induziert oder reprimiert werden können. Bakterien nutzen verschiedene Signalmoleküle, die sich zum Teil nur in der Länge ihrer Seitenketten unterscheiden. Es sind vier Hauptgruppen bekannt: das LuxR/I-Typ System, das hauptsächlich von Gram-negativen Bakterien genutzt wird mit AI-1, dem Acyl-Homoserinlacton als Signalmolekül, das Peptidsignalsystem der Gram-positiven Bakterien mit modifizierten kurzen Peptiden als Pheromon, das luxS/AI-2Signalmolekül, ein zyklischer Furanosyl-Borat-Diester, der zur Kommunikation zwischen den Bakterienarten dient und das AI-3- / Epinephrin- / Norepinephrinsystem mit noch nicht identifizierter Struktur, um zwischen den Arten und Reichen zu vermitteln (Reading & Sperandio, 2006).

1.8 Bakterielle Signaltransduktionswege Die Signaltransduktion dient dem bakteriellen Organismus zur Reaktion auf äußere Reize, die umgewandelt und ins Zellinnere weitergeleitet werden. Zunächst erfolgt die Signalaufnahme durch verschiedene Rezeptortypen, bevor es zur Weiterleitung über Proteinnetzwerke bzw. Signalkaskaden wie beispielsweise Zweikomponentensensoren kommt, um die Transkription der aktuellen Situation entsprechend anzupassen. Zweikomponentensysteme sind für Bakterien die wichtigsten Systeme, um Umweltreize zu registrieren und zu verarbeiten. Allein in E. coli findet man über 30 verschiedene. Seite | 12

1.8 Bakterielle Signaltransduktionswege

1.8.1 Zweikomponenten-Histidinkinasesysteme Das Zweikomponentensystem ist eine Form der Signalweiterleitung in der Zelle, das den Bakterien eine Anpassung an verschiedene Stimuli ihrer Umgebung erlaubt. Es besteht aus zwei Proteinkomponenten, in der Regel aus einem Transmembranmolekül, das als Sensor funktioniert und einem zytoplasmatischen Protein, das als Regulationsprotein bzw. Antwortregulator dient. Der Sensor ist seiner Funktion nach eine Histidinkinase, die ein Homodimer mit drei funktionellen Domänen ausbildet: die Sensor-, Phosphotransfer- und ATP-Bindedomäne. Die Kinase reagiert auf ein Signal im periplasmatischen Raum mit Hydrolyse von ATP zu ADP und Autophosphorylierung von Histidin (Hakenbeck & Stock, 1996). Das phosphorylierte Histidin hat ein hohes Phosphorylgruppenübertragungspotential, so dass es in einem nächsten Schritt leicht zum Phosphotransfer auf ein spezifisches Aspartat in der Phosphoakzeptordomäne des Regulatorproteins kommt (Parkinson, 1993). Dieses Protein trägt noch eine weitere Domäne: die Regulatordomäne. Durch Konformationsänderung, bedingt durch die Phosphorylierung, wird das aktive Zentrum des Regulatorproteins frei, so dass es schließlich zur Bindung an den Zielpromotor kommt und die Transkription der Zielgene geändert werden kann.

1.8.2 Das System QseBC Die Proteine QseB und QseC bilden ein funktionelles Zweikomponenten-Histidinkinasesystem. Erstmalig beschrieben wurde es in enterohämorrhagischen E. coli Stämmen (EHEC), inzwischen wurde es in zahlreichen Pathogenen nachgewiesen, aber beispielsweise auch in kommensalen E. coli Stämmen und anderen harmlosen Bewohnern des Gastrointestinaltraktes. QseC entspricht der Sensorkinase und QseB dem entsprechenden Response-Regulator. Die Histidinkinase QseC reagiert als Sensor für drei nachgewiesene Reizmoleküle: AI-3, das prokaryontische Quorum sensing Pheromon und Adrenalin sowie Noradrenalin als eukaryontische Wirtshormone. Als Reaktion auf den Reiz von außen wird QseC autophosphoryliert und überträgt den Phosphatrest autokatalytisch auf den Aspartatrest von QseB. QseB aktiviert mehrere Gene von einigen virulenzrelevanten bzw. direkten Virulenzfaktoren wie Shiga-Toxin, Stx1 und Stx2 und das Eae Protein (Intimin) (Dowd, 2007). Es bindet als Folge seiner Phosphorylierung beispielsweise an den Promotor von flhDC, der die Flagellensynthese aktiviert. Es aktiviert Gene, welche die Motilität betreffen und bindet schließlich auch an seinen eigenen Promotor, mit dem Ergebnis einer positiven Autoregulation der eigenen Transkription. Insgesamt betrachtet kann QseC als Virulenzregulator bezeichnet werden, der eine Rolle in der bakteriellen Pathogenese durch Regulation verschiedener Virulenzgene spielt. Aufgrund dessen Seite | 13

1 Einleitung

wird es als potentielles drug target angesehen, das in vielen Gram-negativen, pathogenen Bakterien zu finden ist, im Wirt hingegen nicht. Über erste positive Forschungsergebnisse wurde berichtet (Rasko et al., 2008).

1.8.3 Das Protein YgiW YgiW ist ein konserviertes Protein weitgehend unbekannter Funktion von 130 Aminosäuren, einem Molekulargewicht von 14 kDa und einem theoretisch ermittelten isoelektrischen Punkt von pI 5,08. Es wird von E. coli produziert und in den periplasmatischen Raum sezerniert. Das entsprechende codierende Gen liegt in unmittelbarer Nachbarschaft, aber in entgegengesetzter Richtung zum qseBC-Operon an der Position 3.157.898 bis 3.177.106 bp (E. coli K-12 MG1655). Seine Sekundärstruktur ist der Abbildung 1-4 zu entnehmen.

Abbildung 1-4: YgiW (links: Ansicht von der Seite, rechts: Ansicht von oben). (Basierend auf Daten der RCSB Protein Data Bank: PDI-ID: 1NNX, Lehmann, C., Galkin, A., Pullalarevu, S., Sarikaya, E., Krajewski, W., Lim, K., Howard, A., Herzberg, O. Structure of the hypothetical protein ygiW from E. coli. Unveröffentlicht. Bearbeitet mit PyMOL von Prof. Dr. Hantke (Lehmann C. et al., 2004)).

Die Position des Gens in direkter Nachbarschaft zu qseBC und die Tatsache, dass sowohl YgiW, als auch QseBC konservierte Proteine in verschiedenen Gram-negativen Bakterien sind, lassen einen potentiellen Zusammenhang in ihrer Funktion vermuten bzw. eine mögliche Beteiligung des Proteins am Informationstransfer oder eine Rolle bei der Signalübertragung. Zusätzlich wurde ein YgiW-Homolog in Shiga-Toxin codierenden Phagen entdeckt, was weitere Fragen diesbezüglich aufwirft.

1.8.4 Die Wirtshormone Adrenalin und Noradrenalin Adrenalin und Noradrenalin bzw. Epinephrin und Norepinephrin sind ihrer Struktur nach Catecholamine (Abbildung 1-5) und funktionieren im menschlichen Körper, dem Wirt vieler Mikroorganismen, als Neurotransmitter und Hormone. Gebildet werden sie aus Tyrosin über Seite | 14

1.9 Ziele der vorliegenden Arbeit

DOPA, Dopamin und Adrenalin schließlich aus Noradrenalin in chromaffinem Gewebe, dem Nebennierenmark und den Paraganglien des Sympathikus. Noradrenalin unterscheidet sich von Adrenalin in seiner Struktur durch das Fehlen einer Methylgruppe an der Aminogruppe und physiologisch durch z. T. schwächere, aber teilweise auch gegensätzliche Wirkungen. Als so genanntes Stresshormon bedingt Adrenalin u. a. eine Steigerung von Herzfrequenz, während Noradrenalin die Pulsfrequenz senkt. Beide steigern den Blutdruck und erweitern die Bronchien, vermindern die Darmperistaltik und bewirken eine Grundumsatzsteigerung durch Förderung des Sauerstoffverbrauchs. Ihre Wirkungen vermitteln sie über adrenerge Rezeptoren des sympathischen Systems. Sie weisen beide eine Catecholstruktur auf wie Enterobactin oder Salmochelin auch. Außerdem haben Clarke et al. (Clarke et al., 2006) gezeigt, dass das bakterielle Zweikomponentensystem QseBC als adrenerger Rezeptor fungiert und beide Hormone als Signalmoleküle erkennt, so dass weitere Untersuchungen bezüglich deren Rolle und Funktion in Bakterien durchgeführt wurden.

Abbildung 1-5: Darstellung der Strukturformeln von Adrenalin / Epinephrin (links) und Noradrenalin / Norepinephrin (rechts), beides Catecholamine (erstellt mit: Formeleditor). Die Catecholstruktur ist rot markiert.

1.9 Ziele der vorliegenden Arbeit Die Interaktion des Säugerproteins Siderocalin mit Enterobactin ist zwischenzeitlich gut untersucht. Bei dem strukturähnlichen, aber hydrophileren Siderophor Salmochelin S4 hingegen war unklar, ob es von Siderocalin gebunden werden kann, oder ob die zwei Zuckerreste eine Bindung in der tassenartigen Struktur verhindern. Auch die Frage, ob Nicht-Catecholsiderophore wie Yersiniabactin gebunden werden, war nicht geklärt. Eine weitere interessante Frage war, ob die wirtseigenen Hormone wie Adrenalin oder Noradrenalin, die strukturelle Ähnlichkeit mit Catecholat-Siderophoren aufweisen, von Siderocalin gebunden werden. Es besteht die Möglichkeit, dass relativ labile, aus drei Catecholmonomeren gebildete Eisenkomplexe durch eine Bindung an Siderocalin stabilisiert werden.

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1 Einleitung

In einem zweiten Teil der Arbeit sollte die Funktion des Zweikomponentensystems QseBC untersucht werden. In pathogenen Bakterien soll dieses Regulationssystem die Hormone des Wirtes, Adrenalin und Noradrenalin, sowie ein noch unbekanntes Quorum sensing-Signal von Bakterien erkennen. Die Funktion von QseBC in Kommensalen ist noch unbekannt. Dazu sollte der Einfluss von Deletionen in den Genen qseBC und ygiW auf die eisenregulierten Systeme Fes, FepA und IroN untersucht werden. Die Analysen sollten außerdem den Einfluss dieser Mutationen auf die Enterobactinproduktion, die Motilität und die Biofilmbildung näher beleuchten.

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2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Geräte Verwendete Geräte, ihre Typbezeichnung und Herkunft sind den folgenden Auflistungen zu entnehmen.

Gerät

Typ und Herkunft

BBL GasPak™ System

Gefäß zur Anaerobieranzucht 100, Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, D.) Fermenter Biostat E (10 l Arbeitsvolumen), Blattrührfermenter, B. Braun Biotech International GmbH (Melsungen, D.); Giovanola b20 (20 l Arbeitsvolumen), Schlaufenreaktor, Umwerffermenter, Giovanola AG für Verfahrenstechnik, Giovanola Fères (Monthey, Schweiz) French Press, Zelle French® Pressure Cell Press, Cell Type 40 K, 20 K, Mini Cell, French Pressure Cell Thermo Spectronic, FA-031 (klein), 4-339 (groß) SLM-Aminco® Spectronic Instruments Inc. (Rochester, NY, USA und Maryland, Silverspring, USA) HPLC analytisch: analytische HPLC (Shimadzu Europa GmbH, Duisburg, D.): Shimadzu Liquid Chromatograph LC-10 AT Systemkontrolle: System Controller SCL-10 A Detektor: UV-VIS Spectrophotometric Detector SPD-10 AV Fluorescence Detector RF-10 AXL Pumpen: LC-10 AT Injektor: Auto Injector SIL-10 AXL präparativ: präparative HPLC (Shimadzu Europa GmbH, Duisburg, D.): Shimadzu preparative Liquid Chromatograph LC-8 A Systemkontrolle: System Controller SCL-6 B Detektor: UV-VIS Spectrophotometric Detector SPD-6 AV Pumpen: LC-8A Injektor: manuelle Injektion Kollektor: Fraktionierer Pharmacia Biotech fraction collector Frac-100 (Uppsala, Schweden), GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D.) Säulen und Säulenmaterial: Säule: ReproSil-Pur C18 (Ultrapure HPLC-Phases), 5 µm, 250 x 4 mm (reversed phase column) (analytisch) mit Vorsäulen: ReproSil-Pur ODS-3,5 µm, 10 x 4mm; Säule: Nucleosil 100 C18, 7 µm, 250 x 20 mm (reversed phase column) (präparativ) Alle von Dr. Maisch GmbH (Ammerbuch, D.) Spectro-Photometer Novaspec II (Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg, D.), GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D.) Thermocycler TPersonalCycler P, Biometra GmbH (Göttingen, D.) Seite | 17

2 Material und Methoden

Ultraschall-Kompaktgerät

UV-Gerät Wasserreinigungsanlage

Entgasungsanlage (Fließmittel HPLC), Branson Bransonic 8200, G. Heinemann Ultraschall- und Labortechnik (Schwäbisch Gmünd, D.) Mighty Bright, Hoefer Scientific Instruments (San Francisco, USA), Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg, D.) TKA-GenPure Reinstwassersystem, Water purification systems, TKA GmbH Wasseraufbereitungssysteme (Niederelbert, D.); Millipore GmbH (Schwalbach, D.)

Nicht Aufgeführtes stammt von diversen Anbietern für Laborzubehör.

2.1.2 Verbrauchs- und Kleinmaterialien Verwendete Verbrauchs- und Kleinmaterialien, ihre Typbezeichnung und Herkunft sind der folgenden Auflistung zu entnehmen.

Bezeichnung

Typ und Herkunft

Dialysier-Schlauchmembran / -halter

ZelluTrans aus regenerierter Cellulose, 3,5, 19 mm Breite, MWCo: 4.000-6.000, Wandstärke 25 µm, Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D.) 1 ml, 5 ml, Glutathione Sepharose™, Amersham Biosciences, GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D.) 5 ml, Amersham Biosciences, GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D.) Cellstar®, Greiner Bio-One GmbH (Frickenhausen, D.); Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D.) Centriprep®, Ultracel YM-10/30 Membran (10.000/30.000 Nominal Molecular Weight Limit), Amicon® Bioseparations, Millipore Corporation (Billerica, MA, USA), Millipore GmbH (Schwalbach, D.)

GSTrap Säule HiTrap Desalting Säule Zellkultur Multiwell Platten ZentrifugationsfilterRöhrchen

Nicht Aufgeführtes stammt von diversen Anbietern für Laborzubehör.

2.1.3 Chemikalien Standardchemikalien analytischen Reinheitsgrades wurden von Applichem (Darmstadt, D.), Boehringer Mannheim bzw. Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, D.), Difco Laboratories (Detroit, MI, USA), Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg, D.), Merck KGaA (Darmstadt, D.), Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D.), Sarstedt AG (Nümbrecht, D.), Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg, D.) und Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München, D.) (mit Riedel-de-Haën AG (Seelze, D.) und Fluka AG (Buchs, Schweiz)) bezogen. Spezielle ChemiSeite | 18

2.1 Material

kalien für verschiedene Experimente werden nachfolgend unter Angabe ihrer Bezugsquelle aufgeführt.

Chemikalie

Typ und Herkunft

2,3-Dihydroxybenzoic acid 2,3-Dihydroxybenzoylserin Acetonitril

Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München, D.) EMC microcollections GmbH (Tübingen, D.) J.T. Baker, Mallinckrodt Baker B.V. (Deventer, Niederlande) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München, D.) Bio-Rad Laboratories (München, D.) Novartis Pharma (Basel, Schweiz), SigmaAldrich Chemie GmbH (München, D.) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München, D.) EMC microcollections GmbH (Tübingen, D.) Gibco BRL, Invitrogen GmbH (Karlsruhe, D.) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München, D.)

Adrenalin / (-)-Epinephrine Bio-Gel® P-2 Polyacrylamide Gel Desferal®, Desferrioxamin B, Deferoxamine mesylate salt EDDHA Enterobactin FBS Hydroxyalkoxypropyl-Dextran Type VI (Lipidex) L-Glutathion reduziert MacConkey-Agar Noradrenalin / DL-Norepinephrine hydrochloride RPMI 1640 + L-Glutamin Transferrin (T.; Holo-T., Apo-T.) Trifluoressigsäure X-Gal

Fluka AG (Buchs, Schweiz) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München, D.)) Difco Laboratories (Detroit, MI, USA), Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg, D.) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München, D.) Gibco BRL, Invitrogen GmbH (Karlsruhe, D.) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München, D.) Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg, D.), Merck KGaA (Darmstadt, D.) Genaxxon BioScience GmbH (Ulm, D.)

2.1.4 Elektrophoresemarker Marker

Eigenschaften und Herkunft

1 kb DNA Ladder

0,5-10 kb, New England BioLabs GmbH (Frankfurt a. M., D.) DNA Ladder 1 kb Größenstandard Invitrogen GmbH (Karlsruhe, D.) GeneRuler™ 1 kb DNA Leiter 0,25-10 kb, Fermentas GmbH (St. Leon-Rot, D.) PageRuler™ Prestained Protein 10-250 kDa, Fermentas GmbH (St. Leon-Rot, D.) Ladder Plus Prestained Protein Ladder 11-170 kDa, Fermentas GmbH (St. Leon-Rot, D.) ® Roti -Mark Prestained 17-245 kDa, Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D.) Unstained Protein Molecular 14,4-116 kDa, Fermentas GmbH (St. Leon-Rot, D.) Weight Marker

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2 Material und Methoden

2.1.5 Enzyme Enzyme analytischen Reinheitsgrades wurden von New England BioLabs GmbH (Frankfurt a. M., D.), Boehringer Mannheim bzw. Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, D.), Merck KGaA (Darmstadt, D.), Carl Roth GmbH (Karlsruhe, D.), Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg, D.) und Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München, D.) (mit Riedel-de-Haën AG (Seelze, D.) und Fluka AG (Buchs, Schweiz)) bezogen. Weitere Bezugsquellen werden neben dem entsprechenden Stoff aufgeführt. Für Reaktionen mit diesen Enzymen wurden die vom entsprechenden Hersteller empfohlenen Puffer bzw. Protokolle eingesetzt und eingehalten.

Enzym

Herkunft

DNA Polymerase DNase I FastStart Taq DNA Polymerase High Fidelity Lysozym Proteinase K Pwo SuperYield DNA Polymerase + dNTPack (10mM) Restriktionsendonucleasen

New England BioLabs GmbH (Frankfurt a. M., D.) Genaxxon BioScience GmbH (Ulm, D.) Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, D.) Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, D.) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (München, D.) Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, D.) Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, D.)

T4 DNA Ligase Taq DNA Polymerase

New England BioLabs GmbH (Frankfurt a. M., D.), Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, D.), Fermentas GmbH (St. Leon-Rot, D.) Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, D.) Fermentas GmbH (St. Leon-Rot, D.), peqlab Biotechnologie GmbH (Erlangen, D.)

2.1.6 Ready-to-use Kits Bezugsquellen verwendeter Kits sind nachfolgend aufgeführt.

Kit

Herkunft

Anaerocult® P und A und Anaerobier Kit, Merck KGaA (Darmstadt, D.) Anaeroclip BCA™ Protein Assay Kit Pierce (Rockford, IL, USA), Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA) Easy-DNA Extraction Kit Invitrogen GmbH (Karlsruhe, D.) Expand High Fidelity PCR- Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, D.) Kit Ni-NTA Purification Kit His-Tag-Aufreinigung, Qiagen GmbH (Hilden, D.) Nucleobond® Xtra Midi Macherey-Nagel GmbH (Düren, D.) Seite | 20

2.1 Material

NucleoSpin® Extract II Kit

PCR clean-up Gel extraction, Macherey-Nagel GmbH (Düren, D.) peqGOLD Plasmid Miniprep peqlab Biotechnologie GmbH (Erlangen, D.) Kit I QIAquick PCR Purification Qiagen GmbH (Hilden, D.) Kit Thrombin Cleavage Capture Novagen® , WI, USA, Merck KGaA (Darmstadt, D.) Kit

2.1.7 Nähr- und Kulturmedien Nähr- und Kulturmedien wurden mit deionisiertem Wasser (VE-H2O) angesetzt und sofern nicht anders gekennzeichnet, durch Autoklavieren sterilisiert. Verwendete Chemikalien entsprechen p. a. Qualität.

Medium

Zusammensetzung

M63 MinimalMedium

MacConkey-Laktose

NB

NBD

Schwärm- / MotilityMedium

KH2PO4 K2HPO4*3H2O (NH4)2SO4 autoklavieren 1 M MgSO4 0,1 M CaCl2 eventuell mit CQuelle: 60 % Glycerol eventuell mit Eisenzusatz VE-H2O MacConkey Agarbase Laktose VE-H2O Nutrient Broth NaCl VE-H2O Nutrient Broth NaCl VE-H2O autoklavieren Dipyridyl Trypton NaCl VE-H2O

pH 5,6 12,9 g 1,1 g 2g

pH 7,0 5,3 g 3,9 g 2g

pH 7,4 2,6 g 18,5 g 2g

pH 7,6 1,8 g 19,8 g 2g

1 ml 1 ml

1 ml 1 ml

1 ml 1 ml

1 ml 1 ml

10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

ad l l

ad 1 l

ad 1 l

ad 1 l

40 g 10 g ad 1 l 8g 5g ad 1 l 8g 5g ad 1 l 0,2 mM 10 g 2,5 g ad 1 l Seite | 21

2 Material und Methoden

SOC

TA

TY

λ-Phagen-Medium

Trypton Hefe Extrakt NaCl KCl VE-H2O autoklavieren MgCl2 MgSO4 Glucose Trypton NaCl VE-H2O autoklavieren Dipyridyl EDDHA Bacto Trypton Hefe Extrakt NaCl VE-H2O Trypton NaCl VE-H2O

2g 0,5 g 10 mM 2,5 mM ad 100 ml 10 mM 10 mM 20 mM pH 7 8g 5g ad 1 l 0,2 mM 5 mM 8g 5g 5g ad 1 l 10 g 2,5 g ad 1 l

2.1.8 Medienzusätze Je nach Versuchsansatz wurden den verwendeten Medien weitere Bestandteile zugefügt. Für Festmedien / Platten Agar, zur Selektion Antibiotika, X-Gal etc. sowie weiteres Spezifisches, je nach Vesuchsansatz. Die Zugaben und deren Arbeitskonzentrationen usw. sind nachfolgend aufgelistet.

Agar Agar-Agar Kobe I wurde je nach Einsatz in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt.

Verwendung

Konzentration

Platten Schwärm- / Motility-Agar TA-Agar Topagar λ-Agar

15 g/l 3 g/l 5 g/l 6 g/l 10 g/l

Seite | 22

2.1 Material

Antibiotika Durch Zugabe eines Antibiotikums zu Kulturmedien, wurde ein Selektionsdruck geschaffen, der zur selektiven Bakterienanzucht genutzt wurde. Das Antibiotikum wurde jeweils nach Sterilfiltration und Abkühlen des Nährmediums auf unter 50°C diesem zugegeben. Für diese Arbeit verwendete Antibiotika und deren Einsatz sind nachfolgend aufgeführt.

Antibiotikum

Stammlösung Arbeitskonzentration

Lösungsmittel

Ampicillin (β-Lactame) Chloramphenicol (Benzolderivat) Kanamycin (Aminoglycosid) Neomycin (Aminoglycosid) Tetracyclin (Tetracyclin)

5 mg/ml 40 mg/ml

50 µg/ml 40 µg/ml

VE-H2O 70 % Ethanol

50 mg/ml 5 mg/ml 12,5 mg/ml

50 µg/ml 50 µg/ml 15 µg/ml

VE-H2O VE-H2O 70 % Ethanol

Sonstiges Weitere Zusätze und deren Einsatz sind nachfolgend aufgeführt.

Zusatz

Stammlösung / Arbeitskonzentration

Desferal® DHB Dipyridyl EDDHA FeSO4 Glucose Glycerol IPTG X-Gal

10 mM / 1 mM, 10 µM oder 50 µM 10 mM / 100 µM 100 mM / 150 µM oder 200 µM 5 mM / 150 µM 40 µM / 0,2 mM 40 % / 0,1 % oder 0,2 % 60 % / 0,6 % 100 mM / 0,3 mM 20 mg/ml in N-N-Dimethylformamid / 0,2 mg/ml

2.1.9 Lösungen und Puffer In dieser Arbeit verwendete Lösungen und Puffer, deren Zusammensetzung und die Art der Anwendung sind nachfolgend, sortiert nach Verwendung, aufgeführt. Lösungen und Puffer wurden mit deionisiertem Wasser (VE-H2O) oder Reinstwasser angesetzt und sofern nicht anders gekennzeichnet, durch Autoklavieren sterilisiert. Verwendete Chemikalien entsprechen p. a. Qualität.

Seite | 23

2 Material und Methoden

Verwendung / Bezeichnung

Stammlösung Zusammensetzung

Agarose-Gelelektrophorese Agarosegel

Ethidiumbromid-Färbebad

Gelladepuffer

Stoppmix

TAE-Puffer

0,8 %

Agarose TAE-Puffer Höher- bzw. niedriger-prozentige Gele Agarosegehalt entsprechend angepasst. 10 mg/ml Ethidiumbromid TAE-Puffer 10-fach Bromphenolblau gelöst in 150 mM Tris pH 7,6 Glycerol VE-H2O 10-fach Ficoll EDTA pH 8 SDS Bromphenolblau VE-H2O 50-fach Tris Essigsäure 0,5 M EDTA pH 8,0 VE-H2O

0,4 g 50 ml wurden in ihrem

100 µl 500 ml 250 mg 33 ml 60 ml ad 100 ml 20 % 0,1 M 1% 0,25/0,5 % 121 g 28,55 ml 50 ml ad 500 ml

SDS-PAGE Elektrophorese-Laufpuffer

10-fach

Entfärbelösung

Färbelösung

Sammelgel

Seite | 24

4,2 %

Glycin SDS Tris VE-H2O Essigsäure Ethanol VE-H2O Ethanol Essigsäure Coomassie Brillant Blue R-250 VE-H2O Rotiphorese® Gel 30 VE-H2O Sammelgelpuffer (0,25 M Tris/HCl, pH 6,8) 10 % SDS 100 mg/ml APS TEMED

144 g 10 g 30 g ad 1 l 75 ml 50 ml 875 ml 450 ml 100 ml 2,5 g 450 ml 1,72 ml 4 ml

6,3 ml 120 µl 80 µl 30 µl

2.1 Material

SDS-Probenauftragspuffer

2-fach

Trenngel

11 %

Tris/HCl pH 6,8 SDS Glycerol Bromphenolblau β-Mercaptoethanol VE-H2O Rotiphorese® Gel 30 VE-H2O Trenngelpuffer (1,5 M Tris/HCl, pH 8,8) 10 % SDS 100 mg/ml APS TEMED

100 mM 4% 20 % 0,02 % 10 %

MgSO4 CaCl2 VE-H2O Tris base MgSO4.7H2O Gelatine VE-H2O mit HCL pH auf 7,4 einstellen

0,1 M 0,005 M

Glutathion TSED Imidazol Complete, EDTA-free Puffer A Lysozym DNase PBS Dnase Complete, EDTA-free Puffer A Nickel-ChelatAgarose-Suspension, Qiagen GmbH (Hilden, D.) NaCl KCl Na2HPO4x2H2O KH2PO4 VE-H2O

5 mM

7,3 ml 7 ml 5 ml 400 µl 100 µl 50 µl

Lösungen für Arbeiten mit Phagen P1-Phage: Adsorptionpuffer λ-Phage: λ-dil (TMG Puffer)

1,21 g 1,2 g 0,1 g ad 1 l

Proteinaufreinigung Elutionspuffer (GST-Tag) Elutionspuffer (His-Tag)

Frenchpresspuffer (GST-Tag)

Frenchpresspuffer (His-Tag)

Ni-NTA-Spin-Säule (His-Tag)

PBS (GST-Tag)

10-fach

200 mM 1 Tabl./50 ml 0,3 mg/ml 0,05 mg/ml 0,05 mg/ml 1 Tabl./50 ml

80 g 2g 7,6 g 2g ad 1 l

Seite | 25

2 Material und Methoden

Puffer A (His-Tag)

K-Phosphatpuffer MgCl2 NaCl Mercaptoethanol VE-H2O Tris/HCl NaCl EDTA DTT VE-H2O

TSED Waschpuffer (GST-Tag)

Waschpuffer (His-Tag)

Imidazol Complete, EDTA-free Puffer A

20 mM 0,5 mM 150 mM 2 mM 50 mM 100 mM 1 mM 1 mM pH 8 20 mM 1 Tabl./50 ml

β-Galaktosidase-Assay β-Galaktosidase-Puffer

Na2HPO4*2H2O NaH2PO4*H2O Reinstwasser autoklavieren 1 M MgSO4 DTT ONPG in β-GalaktosidasePuffer

ONPG-Lösung

1,07 g 0,55 g ad 100 µl 100 µl 5 mM 5 mg/ml

Herstellung kompetenter Zellen und Transformation Chemisch Elektroporation

GYT

SOC

CaCl2 Glycerol Hefe Extrakt Trypton VE-H2O Trypton Hefe Extrakt NaCl MgSO4 MgCl2 VE-H2O

10 % 0,125 % 0,25 % 2% 0,5 % 10 mM 10 mM 10 mM

Glycerolkultur TY 60 % Glycerollösung

Seite | 26

1 ml 500 µl

2.1 Material

HPLC Fließmittel 1

Acetonitril TFA Reinstwasser Acetonitril TFA

Fließmittel 2

6% 0,1 %

0,1 %

Vor Verwendung wurden die Fließmittel vollständig entgast. Arnow-Test Arnow-Reagenz

Natriumnitrit NaNO2 Natriummolybdat Na2MoO4 Reinstwasser 6M 6M

HCl NaOH

10 g 10 g ad 50 ml

2.1.10 Bakterienstämme und Phagen Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme und Phagen, jeweils mit ihrer Charakteristik und Quellenangabe, sind nachfolgend aufgeführt.

Stamm / [Nr.]

Elter

Bakterienstämme E. coli A0 34/86 [5741] E. coli ABU 83972 [5814] E. coli BL21 (DE3) [2173] E. coli mpk 2 [5916] E. coli Nissle 1917 [5603] E. coli UTI [5684] E. coli UTI [5685] Salmonella enterica ssp. Typhimurium TA2167 [205] Salmonella r AIR 50 [5544] E. coli K-12 Stämme 81 Mutante B14 82 Mutante AW405

Genotyp / relevante Eigenschaften

Referenz

kommensaler E. coli, Colinfant, O83 : K24 : H31, Einsatz als Probiotikum apathogener Bakteriurie Stamm, produziert Enterobactin, Aerobactin und Yersiniabactin, iut+, iro+, sitABCD+, chuA+ Expressionsstamm mit T7 RNA-Polymerase unter lac-Kontrolle, F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) met, langes LPS (glatt)

Dobrindt, U. (2005)

Mutaflor®; Einsatz als Probiotikum; Produktion der Siderophore Enterobactin, Salmochelin, Aerobactin und Yersiniabactin UTI; ähnlich E. coli Nissle 1917 UTI; ähnlich E. coli Nissle 1917 hisC3076 galE506

Dobrindt, U. (2003)

Salmochelinproduktion (aroA::Tn10 revertiert) iroD::kan

Bäumler (2002)

ΔygiW::cat ΔygiW::cat

dieses Institut dieses Institut

Dobrindt, U. (2006)

Studier & Moffatt (1986) Frick (2007)

Dobrindt, U. (2003) Dobrindt, U. (2003) Ames et al. (1974)

Seite | 27

2 Material und Methoden AB2847 [86]

aroB, tsx, malT, thi

AW405 [82]

Chemotaxis Teststamm, T5 sensitiv, Δthr1(am) Δara-14 ΔleuB6 Δlac-41 Δgal? Δhis-4 ΔrpsL136 Δxyl-1 ΔmetF159(am) Δmtl-1 ΔfhuA31? Δtsx-78 Δthi-1 Chemotaxis Teststamm, ΔrpsL, ΔfhuA F- Δ(araD-araB)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3), λ-, rph1, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR514 Allgemeiner Klonierungsstamm, F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rKmK+), λ– aroB lac aroB, Δlac ΔentC ΔentF::kan ΔentF::kan ΔentF::kan ΔygiW::cat Δlac ΔentF ΔygiW::cat ΔentF λpiroN-lacZ ΔentF ΔygiW::cat λpiroN-lacZ λpiroN-lacZ ΔentC ΔqseC::kan ΔentC ΔygiW::cat ΔentC ΔygiW::cat λpiroN-lacZ ΔentC ΔqseC::kan λpiroN-lacZ ΔentC λpiroN-lacZ λpiroN-lacZ ΔqseC::kan λpfes-lacZ ΔygiW::cat Δlac λpfes-lacZ λpfes-lacZ ΔentC λpfes-lacZ ΔqseC::kan λpfepA-lacZ ΔygiW::cat Δlac λpfepA-lacZ ΔentC ΔqseC::kan λpfepA-lacZ ΔentC ΔygiW λpfepA-lacZ λpfepA-lacZ ΔentC λpfepA-lacZ ΔlacZ rrnB P1´ kan λpiroN-lacZ

B14 [81] BW25113 [5863] DH5α [5074]

H0456 [456] H1443 [1443] H5687 [5687] H5711 [5711] H5716 [5716] H5730 [5730] H5737 [5737] H5738 [5738] H5751 [5751] H5753 [5753] H5757 [5757] H5780 [5780] H5781 [5781] H5784 [5784] H5787 [5787] H5820 [5820] H5831 [5831] H5881 [5881] H5882 [5882] H5885 [5885] H5886 [5886] H5905 [5905] H5906 [5906] H5907 [5907] H5908 [5908] H5909 [5909] H5910 [5910] H5936 [5936]

H5937 [5937] H5938 [5938] H5964 [5964] H5965 [5965] H5972 [5972] H5978 [5978] H5983 [5983] H5987 [5987] H5988 [5988] H5989 [5989] H5992 [5992] H5993 [5993] H5994 [5994]

Seite | 28

AB2847 MC4100 MC4100 MG1655 H5711 H5716 BW25113 H5730 H5730 H5738 H5751 H5687 H5687 H5781 H5687 H5687 MC4100 JW2994 H5737 BW25113 H5687 JW2994 H5737 H5780 H5781 BW25113 H5687 CF1648; MG1655 Cashel, M. CF1651 CF1693 WL311 W3110 W3110 BW25113 H5796 H5978 MG1655 MC4100 H1443 H1443 H1443

ΔrelA::kan ΔlacZ rrnB P1´ λpiroN-lacZ ΔrelA::kan ΔspoT::cat ΔlacZ rrnB λpiroN-lacZ ΔlacU169 λpiroN-lacZ λpiroN-lacZ λpfepA-lacZ ΔqseB::kan ΔqseB λpfepA-lacZ ΔqseB λpfepA-lacZ λpfepA-lacZ λpfepA-lacZ aroB, Δlac, λpfes-lacZ aroB, Δlac, λpfepA-lacZ aroB, Δlac, λpiroN-lacZ

Pittard & Wallace (1966) Adler, J. (1990)

Adler, J. (1990) Datsenko & Wanner (2000) Hanahan, D. (1985)

dieses Institut dieses Institut (1982) dieses Institut (2004) dieses Institut (2005) dieses Institut (2005) dieses Institut (2005) dieses Institut (2005) dieses Institut (2005) dieses Institut (2005) dieses Institut (2005) dieses Institut (2005) dieses Institut (2005) dieses Institut (2005) dieses Institut (2005) dieses Institut (2005) dieses Institut (2006) dieses Institut (2006) diese Arbeit (2007) diese Arbeit (2007) diese Arbeit (2007) diese Arbeit (2007) diese Arbeit (2007) diese Arbeit (2007) diese Arbeit (2007) diese Arbeit (2007) diese Arbeit (2007) diese Arbeit (2007) diese Arbeit (2008)

diese Arbeit (2008) diese Arbeit (2008) diese Arbeit (2008) diese Arbeit (2008) diese Arbeit (2008) Baba et al. (2006) diese Arbeit (2008) diese Arbeit (2008) diese Arbeit (2008) diese Arbeit (2008) diese Arbeit (2008) diese Arbeit (2008) diese Arbeit (2008)

2.1 Material JW 2992-1 [5946] JW2994 [5722] MC4100 [443]

BW25113 BW25113

MG1655 [5538] TOP 10 [10431]

W3110 [16] WL311 [5454] Wood [5796]

W3110 MG1655 Wood

Phagen P1vir λRS45

ΔygiW::kan Δlac qseC::kan F- [araD139]B/r, Δ(argF-lac)169, λ-, e14-, flhD5301, Δ(fruK-yeiR)725(fruA25), relA1, rpsL150(strR), rbsR22, Δ(fimB-fimE)632(::IS1), deoC1 F- λ-, rph-1 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ ΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL endA1 λF-λ-, IN(rrnD-rrnE)1, rph-1 ΔlacU169 ΔqseB::kan

Zur Herstellung der P1-Lysate für P1Transduktionen imm21 ind1 bla9-lacZSC 24 Herstellung von lacZ-Promotorfusionen

Baba et al. (2006) Blattner, F. (2005) Casadaban, M. J. (1976)

Guyer et al. (1981) Invitrogen GmbH (Karlsruhe, D.) Bachmann, B. J. (1972) Howard, P. (2000) Gonzalez Barrios et al. (2006)

dieses Institut Simons et al. (1987)

2.1.11 Klonierungsvektoren, Plasmide und Plasmidkonstruktionen Verwendete Plasmide und Konstrukte sowie deren Eigenschaften und Referenzen sind nachfolgend aufgeführt.

Plasmid

Eigenschaften

Quelle / Referenz

pBAD/His B Vector

araBAD Promotor, N-terminaler His-Tag, Arabinose Induktion, Ampr, MCS araBAD Promotor, C-terminaler His-Tag, Arabinose Induktion, Ampr, MCS T7 Promotor, N-terminaler GST-Tag, IPTG-Induktion, Ampr, Thrombin Schnittstelle, MCS GST-NGAL-Fusion, Vektor pGEX-4T-3 T7 RNA-Polymerase reguliert von λcl857, Neor iroBCDEN, Ampr, Vektor pWSK29 iroDEN, Ampr, Vektor pWSK29 Klonierung von lacZ-PromotorFusionen, Ampr

Invitrogen GmbH (Karlsruhe, D.)

pBAD/Myc-His B C

pGEX-4T-3

pGEX-4T-3-NGAL pGP1-2 pKHI18 pKHI23 pRS414

Invitrogen GmbH (Karlsruhe, D.) Amersham Biosciences, GE Healthcare Europe GmbH (Freiburg, D.) Bundgaard et al. (1994) Tabor & Richardson (1985) Zhu et al. (2005) Zhu et al. (2005) Simons et al. (1987)

Seite | 29

2 Material und Methoden

pRS415

Klonierung von lacZ-PromotorFusionen, Ampr His-YgiW-Fusion, Vektor pBAD/His B GST-YgiW-Fusion, Vektor pGEX-4T-3

pYH21 pYH9

Simons et al. (1987) dieses Institut (2007) dieses Institut (2007)

2.1.12 Synthetische Oligonukleotide (Primer) und Affinitätstags Zum Zwecke der DNA-Sequenzierung und der -Amplifikation mittels PCR wurden nachfolgend aufgelistete Oligonukleotide der Firma Eurofins MWG Operon (Ebersberg, D.) eingesetzt. Deren Beschreibung sowie die Darstellung der Affinitätstags sind nachfolgend aufgeführt. Primer wurden immer in Konzentrationen von 100 pM/µl eingesetzt und aufbewahrt. Eingesetzt wurden die Primer zur Herstellung der Promotorfusionen und zur Überprüfung von Stämmen, Transduktionen und Klonierungen.

Primer

LaborNr.

DNA-Sequenz in 5`-3`-Richtung

GC %

CygiW

143

52,5

entC_BamHI ENTC_ECORI fepA_BamHI

205 203 207

FEPA_ECORI

201

FEPB_BAMHI fepB_EcoRI FES_BAMHI fes_EcoRI

202 204 200 206

FesBamHI NEOFOR NGAL_BGL2

156 197 163

NGAL-EcoRI

164

QseCEND ygiHind ygiV ygiW_BamHI

196 195 144 170

ATT CCC GGG AAC GCG TCC CGG GAG CGG TAA CAA TTA CGG CAT ATG AAT ATC CTC CTT AG GGA GGA TCC CCT CCA CAA AAT GAT AAA GGC GGA GAA TTC CCT CCA CAA AAT GAT AAA GGC GGA GGA TCC TGT TTT ATT CCT GCA TTT TTG CCA CG GGA GAA TTC TGT TTT ATT CCT GCA TTT TTG CCA CG GGA GGA TCC GTC TCA CAA ATC AGC TTC CTG GGA GAA TTC GTC TCA CAA ATC AGC TTC CTG CGA GGA TCC TTC GTC ATT CAG ACG CTG CC CGA GAA TTC TTC GTC ATT CAG ACG CTG CCA TTC C CCG GAT CCA ACA TTT CGT CAT TCA GAC GC AGA CAA TCG GCT GCT CTG AT GCA GAG ATC TCA GGA CTC CAC CTC AGA CCT GAT CC CGG AAT TCT CAG CCG TCG ATA CAC TGG TCG ATT GGG CTT TAT GCG GGA AAT GTT CG GGA AGC TTA CGG ATT TAC TTT GCG GAT CTG AGC AAT TCA GGG CTA CAG CGG TG GGT TCC GCG TGG ATC CGC AGA GCA GGG CGG TTT TTC TGG

Seite | 30

50 43,3 45,7 40 53,3 46,7 58,6 50 51,7 50 57,1 55,6 45 46,7 56,5 64,1

2.1 Material

YgiW_XhoI

169

ygiW2xhoI

213

ygiWHind4 ygiWint ygiWprombam

226 145 221

ygiWpromeco

222

YgiWxhoI

194

ygiWXhoI3

225

ygiWXhoI4 ygiXint ygiYint

227 146 147

GAG CTC GAG TCG ACT TAC GGA TTT ACT TTG CGG ATC GAC TCG AGC GCA GAG CAG GGC GGT TTT TCT GG GGA AGC TTG AGC GGT AAC AAT TAC GG TAA GGC CCG TTT TGA TGC CGT CG GAC AGG ATC CAG GGC CAT TAC TGC GAT TAC T GTG TGA ATT CTT GAT GCC GTC GCC AAT CAG C GAG AGC TCA GCA GAG CAG GGC GGT TTT TCT GG AGT CTC GAG GGA GTA ATA AAC ATG AAA AAA TTC GC GGT CTC GAG CGT TAA ATG CTC GGA AAC AG AGG TCA CCA GTA ATG CCG TTG TGC CCG GCA ACA ATC GCC AGC

Bezeichnung

Kennzeichen / Größe

GST-Tag His-Tag

Glutathion S-Transferase, Protein, ca. 23 kDa Poly-His, HHHHHH, 2-10 (meist 6), 0,84 kDa

50 62,5 50 56,5 51,6 51,6 59,4 37,1 51,7 52,4 66,7

2.1.13 Hardware Die Auswertung und Dokumentation von Daten und Ergebnissen erfolgte mit Windows PCs (Microsoft Deutschland GmbH, Unterschleißheim, D.) mit Intel Pentium III Prozessoren bzw. einem Intel(R) Core(TM)2 Duo CPU Prozessor (Intel GmbH Munich